抑制PAQR4表达对肝细胞肝癌增殖侵袭的影响及机制

杨达钧 王剑一 莫嘉强 何军明

(1广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2广东省中医院肝胆胰外科)

原发性肝癌是世界范围内常见且致命的肿瘤类型，其中最常见的肝癌组织类型是肝细胞肝癌(HCC)〔1〕。HCC每年新发病例超过70万例，是全球第五大常见肿瘤，是全球肿瘤死亡第三大常见原因，占男性肿瘤相关死亡原因的第二位，而在我国HCC患者新发病例和死亡病例占全球病例的一半〔2，3〕。尽管近年来HCC在手术、化疗和靶向等治疗策略上不断改进，但是HCC的死亡率并没有明显的改善，患者5年生存率仍然很低〔4〕。目前HCC的发病机制尚未完全明确，越来越多的研究报道探索HCC发病的分子基础对改进其治疗策略至关重要。孕激素和脂联素受体(PAQR)4是PAQR家族成员之一，该家族中的成员参与调节许多生物过程，包括代谢和肿瘤进展〔5〕。PAQR4在细胞增殖、细胞周期、细胞分化和细胞死亡等生物过程中发挥至关重要的功能〔6〕。关于PAQR4的研究报道较少，但是其在非小细胞肺癌、胃癌和乳腺癌中被报道为癌基因，促进肿瘤增殖和转移〔7～9〕。PAQR4在HCC中的表达情况及生物学作用未见有报道，本研究旨在探讨抑制PAQR4的表达对HCC增殖侵袭的影响及机制。

1 材料与方法

1.1实验试剂 DMEM-高糖和胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；HCC细胞系HUH-7购于美国ATCC细胞库；PAQR4 siRNA购于上海锐赛生物技术有限公司；25 cm3培养瓶、6孔板和Boyden小室等购于美国Coring公司；MTS试剂和聚偏氟乙烯(PVDF)膜购于美国Promega公司；细胞周期检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；强效RIPA裂解液购于北京Solarbio公司。

1.2细胞培养及慢病毒感染 HUH-7细胞用含有10%FBS DMEM-高糖培养基培养，放置37℃、5%CO2培养箱中孵育。HUH-7细胞呈对数生长期时，消化收集细胞，以2.0×105个/孔铺至6孔板中，分为对照组(si-NC组)和PAQR4 siRNA组(si-PAQR4组)，贴壁12 h后，按说明书将NC siRNA和PAQR4 siRNA与转染试剂Lip2000混匀后加入各组细胞中，放至培养箱中，8～12 h更换新鲜培养基，进行后续实验。

1.3MTS检测细胞活性 HUH-7细胞呈对数生长期时，消化收集细胞，以2 000个/孔铺至96孔板中，每组设置6个复孔，按上述siRNA转染方法转染各组细胞，放至培养箱中培养。在转染细胞24、48、72和96 h时，每孔加入30 μl MTS工作液，37℃培养箱中避光孵育2 h后，全波长扫描仪检测波长490 nm处的吸光度OD值，OD值代表细胞活性。

1.4平板克隆检测细胞克隆形成能力 HUH-7细胞呈对数生长期时，消化收集细胞，以300个/孔铺至6孔板中，分为对照组(si-NC)和PAQR4 siRNA组(si-PAQR4)，每组设置3个复孔，按上述siRNA转染方法转染各组细胞，放至培养箱中培养。培养1 w时，将siRNA再次转染各组细胞，培养至肉眼可见的克隆团形成。弃去培养基，终止培养，PBS洗3次，甲醛固定细胞，结晶紫染色，干燥后计数克隆团的数目。

1.5流式细胞实验检测细胞周期 HUH-7细胞呈对数生长期时，消化收集细胞，以2.0×105个/孔铺至6孔板中，每组设置3个复孔，按上述siRNA转染方法转染各组细胞，放至培养箱中培养。培养48 h时，无EDTA的胰酶收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后，加入4℃的75%酒精固定细胞2～24 h。离心去掉酒精，PBS洗2次后，按照周期试剂检测试剂说明书加入PI染色试剂，37℃避光孵育30 min后，上机进行检测。

1.6Boyden实验检测细胞转移能力 消化收集转染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各组HUH-7细胞，无血清培养基洗3次后，1×105个细胞重悬至100 μl 无血清培养基中，加入24孔板中Boyden小室的上室中，下室趋化因子为500 μl的完全培养基，37℃培养箱中培养，直至在显微镜下观察到细胞穿膜掉入下室后终止培养。PBS洗3次后，甲醇固定细胞，结晶紫染色，干燥后将膜取下中性树胶封片，显微镜下计数穿膜细胞数。

1.7Western印迹检测蛋白表达 消化收集转染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各组HUH-7细胞，PBS洗3次后，细胞斑块中加入RIPA裂解液，细胞完全裂解后，4℃、14 000 r/min离心20 min，收集上清液，按照BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。蛋白加热煮沸变性，80 V、150 min进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，350 mA、120 min条件进行湿转。8%脱脂牛奶室温孵育PVDF膜1 h进行非特异性蛋白封闭。按说明书加入一抗稀释液4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗稀释液室温孵育2 h，采用ECL法显示蛋白条带。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1PAQR4对HCC细胞活性的影响 MTS实验检测发现，si-NC组细胞在24、48、72和96 h的OD值分别为(0.57±0.06)、(0.76±0.11)、(0.95±0.11)、(1.37±0.09)，si-PAQR4组细胞在24、48、72和96 h的OD值分别为(0.56±0.05)、(0.65±0.08)、(0.73±0.07)、(0.84±0.08)，与si-NC组细胞活性相比，si-PAQR4组细胞活性显著降低(均P<0.05)。

2.2PAQR4对HCC细胞平板克隆形成能力的影响 平板克隆形成实验检测发现，siRNA转染HCC细胞HUH-7后，si-NC组细胞克隆团数目〔(112.34±20.15)个〕明显高于si-PAQR4组〔(45.46±9.22)个，P<0.05〕，见图1。

图1 平板克隆形成实验检测干扰PAQR4表达对HCC细胞克隆形成能力的影响(结晶紫)

2.3PAQR4对HCC细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期发现，siRNA转染HCC细胞HUH-7后，si-NC组细胞G0/G1期细胞比例〔(64.33±4.04)%〕明显低于si-PAQR4组〔(73.01±2.99)%，P<0.05〕。

2.4PAQR4对HCC细胞侵袭能力的影响 Boyden实验检测发现，siRNA转染HCC细胞HUH-7后，si-NC组细胞穿膜细胞数〔(38.67±5.41)个〕明显高于si-PAQR4组〔(20.33±4.12)个，P<0.05〕，见图2。

图2 Boyden检测干扰PAQR4表达对HCC细胞转移能力影响(结晶紫，×20)

2.5PAQR4对CyclinD1和基质金属蛋白酶(MMP)-7的影响 Western印迹检测发现，siRNA转染HCC细胞HUH-7后，与si-NC组相比，si-PAQR4组细胞中CyclinD1和MMP-7蛋白表达均降低，见表1和图3。

表1 两组转染后cyclinD1和MMP-7蛋白表达比较

图3 Western印迹检测干扰PAQR4表达对CyclinD1和MMP-7蛋白表达的影响

3 讨 论

HCC是侵袭性恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康〔1～3〕。慢性肝炎、肝硬化是导致HCC的重要原因，乙型和丙型肝炎病毒、黄曲霉素等感染是HCC的高危致病因素〔10,11〕。随着经济的发展，生活水平的提高，酒精性肝炎和脂肪性肝炎的发病增加促使HCC的发生，使得HCC的发病率居高不下〔12,13〕。HCC早期患者治疗主要是局部肿瘤切除和肝脏移植，早期患者1年、3年和5年总生存率相对较高〔14〕。而大多数早期HCC患者无明显临床症状，往往是出现转移临床症状而被确诊，属于HCC晚期患者，错过最佳治疗时间。同时肝细胞的再生和血管侵犯能力极强，手术切除后的早期HCC患者容易发生复发和转移〔15〕，对于晚期和复发HCC患者治疗选择有限，动脉化疗栓塞、放化疗和靶向治疗的联合治疗是主要治疗手段，但是具有相对严重的副作用〔16〕。靶向药物索拉菲尼已经明确可以延长晚期HCC患者几个月的生存时间，因此靶向药物的研究是治疗HCC关键突破点。HCC是一种多基因慢性疾病，涉及复杂的基因和信号通路，在HCC发生发展过程中发挥关键作用的基因可能是治疗HCC的候选靶点。PAQR家族于2005年首次鉴定由7个跨膜通道组成，是一类新发现的膜蛋白受体，含有特有的PFAM-UPF0073结构域，具有高度保守性，其N端朝向细胞质内，C端朝向高尔基体腔内,负责传递和调控胞内信号的作用〔5〕。PAQR家族由人类基因组中PAQR1至PAQR11的11个成员组成，每个PAQR蛋白成员在人体中表达的部位和水平不同，相对应的生物学功能也不相同，目前研究的家族成员蛋白是PAQR1、PAQR2、PAQR3、PAQR5和PAQR7〔17〕。PAQR4的研究相对较少，Wu〔7〕报道在非小细胞肺癌患者中PAQR4在癌组织中的表达显著高于匹配的非癌组织；与正常的乳腺组织相比，PAQR4在82个乳腺癌组织样本中表达上调〔9〕。PAQR4与HCC的研究未见有报道，本研究显示与正常肝组织相比，PAQR4在肝癌组织中的表达显著增加。高表达PAQR4的HCC患者预后较差，提示PAQR4在HCC中高表达，与患者预后不良相关。

研究报道在非小细胞肺癌细胞中过表达PAQR4促进肿瘤细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，而敲低PAQR4的表达抑制肿瘤细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力〔7〕。在胃癌细胞中PAQR4的过表达部分逆转了miR-370对肿瘤细胞增殖、侵袭和上皮间质转化抑制作用〔8〕。RAQR4在HCC细胞中高表达可能促进细胞增殖和侵袭能，具体的作用机制仍需进一步研究。CyclinD1是细胞周期调控的正性因子，作为G0/G1期关键蛋白，促使细胞由G0/G1期进入S期进行细胞分裂〔18〕，其表达减少可使细胞阻滞在G0/G1期，细胞增殖抑制，是抗肿瘤治疗的重要机制之一〔19,20〕。MMP-2属于MMPs家族成员之一，通过降解组织基质促进细胞的迁移、侵袭和转移能力，在肿瘤的侵袭转移中发挥关键作用〔21,22〕，迁移和侵袭是HCC进展和复发的重要步骤，在一定程度上决定了HCC治疗的成功与失败〔23〕。本研究结果表明RAQR4可能通过调控CyclinD1和MMP-2促进HCC细胞增殖和侵袭能力，其深入的作用机制仍需进一步研究。