乳腺癌细胞中骨膜蛋白的表达

何凡 阮剑 宁晓洁 王静

(武汉市第一医院 1甲乳外科，湖北 武汉 430022；2妇科)

骨膜蛋白(POSTN) 是一类由POSTN基因编码的糖蛋白，是基质细胞蛋白的一种〔1〕。POSTN参与多种生理和病理过程。生理情况下，POSTN在胶原纤维原形，伤口愈合等过程中起到重要作用〔2〕。同时POSTN在上皮间质转化(EMT)过程中起到关键作用，而上皮间质转化在胚胎发育的过程中是必不可少的〔3〕。POSTN还在骨骼和牙齿结构的矫正〔4〕，心脏发育过程中起到一定作用〔5〕。近些年来，有不少的研究显示，POSTN还在肿瘤的形成中起到一定作用，然而其具体作用的机制却仍未被阐明。最开始的研究认为，POSTN与表达在癌细胞膜表面的整合素受体结合，并通过加速癌细胞的血管生成和新陈代谢而加速其发展〔6～11〕。新的研究发现，在乳腺癌和大肠癌中，POSTN能通过与整合素αvβ3 和 αvβ5相互作用，诱发蛋白激酶B(AKT/PKB)信号通路的活动〔12，13〕。除此之外，研究人员还发现POSTN能够增强在肿瘤干细胞中Wnt信号通路的活动〔14〕。抑制乳腺癌细胞中POSTN与整合素的结合，能有效抑制乳腺癌细胞的代谢水平和扩散能力〔15〕。正是由于POSTN在多种肿瘤细胞中的高表达，更多的研究热点是希望将其作为肿瘤诊断的标记物。在不同类型肿瘤患者中，癌细胞中高水平表达的POSTN往往与较差的预后相关。这些患者的生存周期显著缩短，淋巴结转移风险明显提高，癌症复发的概率也会增加，同时还有更高程度的耐药性出现〔16～19〕。相同的结果也在离体肿瘤细胞系实验中被证实，即高表达POSTN的肿瘤细胞系表现出更强的侵略性与更强的代谢能力〔20，21〕。有研究表明22，POSTN的表达在浸润性导管癌(IDC)与非浸润性乳腺导管原位癌(DCIS)中是不同的，然而其具体关系仍有待探究。本研究比较不同类型离体乳腺癌细胞系中POSTN的mRNA与蛋白质的表达水平。

1 材料与方法

1.1细胞系 人乳腺癌细胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。其中MCF-7细胞系代表侵入性较弱的乳腺癌细胞，其表达雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)及原癌基因人类表皮生长因子受体(HER)2。SK-BR-3与MCF-7细胞系的侵入性近似，表达PR与HER2，但是不表达ER。MDA-MB-231的侵入性最强，且不表达ER，PR与HER2。

1.2乳腺癌病理材料 收集2015年1月至2018年12月武汉市第一医院病理科材料共计94例，其中DCIS材料44例，IDC材料50例，由高年资病理医师复核组织切片，结合临床表现及影像学资料。

1.3主要试剂与仪器 α-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Gibic公司，实验中用到的抗体购自美国Abcam公司，RNA提取试剂盒RNeasy mini kit购于德国Hilden公司，反转录所需要的cDNA反转录试剂盒购于美国Applied Biosystems公司，免疫组化工具Autostainer Link 48购于丹麦Dako公司。

1.4方法

1.4.1RNA的分离 cDNA合成与实时定量PCR所有RNA均通过RNeasy mini kit提取。通过DM-2000测定提取的RNA的浓度和纯度，并使用cDNA反转录试剂盒进行反转录POSTN mRNA引物由宝生物(大连)工程有限公司合成，选用β-actin作为内参，序列：POSTN上游：GCCATAACATCGGACATA、下游：CTCCCATAATAGACTCAGAAC，退火温度60℃；β-actin上游：ACACTGTGCCCATCTACGAGG、下游：AGGGGCCGGACTCGTCATACT，退火温度60℃。POSTN的定量分析通过ΔΔCt 方法。

1.4.2Western印迹检测 取各细胞系的细胞并用放射免疫沉淀粉析液(RIPA)裂解液提取蛋白分别标记。二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度后，去除蛋白并加入等体积的上样缓冲液后煮沸5 min。将变形的蛋白溶液50 μg/孔等量上样，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后用电转膜仪将其转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脱脂奶粉中封闭，并加入以1∶200稀释的兔源一抗过夜，Tris-Hcl缓冲盐吐温溶液(TBST)洗膜后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000)进行杂交，孵育1 h。洗膜后加入二氨基联苯胺(DAB)进行显色，并放入凝胶成像扫描仪下扫描，使用Image J进行灰度值定量分析。

1.4.3免疫荧光 细胞用4%多聚甲醛溶液固定12 min，并用PBST溶液孵育10 min。之后细胞中加入POSTN一抗，放入4℃过夜。之后使用二抗进行荧光染色，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记细胞核位置。细胞封片后使用共聚焦激光显微镜拍摄。

1.4.4免疫组化 肿瘤标本用4%甲醛溶液固定，脱水并石蜡包埋。使用Autostainer Link 48进行免疫组化反应。标本脱蜡后使用Target Retrieval Solution溶液修复抗原。标本使用兔源一抗室温孵育20 min后继续用二抗孵育20 min，并用DAB显色。标本用苏木素复染，并用酒精干燥脱水，二甲苯透明，封片，用BX41光学显微镜观察。

1.5统计学方法 用GraphPad Prism软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同乳腺癌细胞系中POSTN mRNA表达的差异 对三种乳腺癌细胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN mRNA进行PCR检测，MDA-MB-231细胞系的POSTN mRNA表达(16.21±1.82)明显多于SK-BR-3和MCF-7(10.12±0.48、2.32±0.24，均n=4，F=159.582，P=0.000)，SK-BR-3细胞系的POSTN mRNA表达明显多于MCF-7(P<0.001)。

2.2不同乳腺癌细胞系中POSTN 蛋白质表达的差异 对三种乳腺癌细胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN蛋白质水平进行Western印迹检测，MDA-MB-231细胞系的POSTN 蛋白表达(2.16±0.15)明显多于SK-BR-3和MCF-7(1.48±0.19、1.02±0.09，均n=4，F=59.178，P=0.000)，SK-BR-3细胞系的POSTN 蛋白表达明显多于MCF-7(P<0.000 1)，见图1。

图1 Western印迹检测三种乳腺癌细胞系中POSTN的表达

2.3不同乳腺癌细胞系中POSTN 蛋白表达免疫荧光结果 对三种乳腺癌细胞系进行POSTN蛋白染色发现结果与Western印迹结果类似，MDA-MB-231细胞系的POSTN 蛋白质表达(21.35±2.65)明显多于SK-BR-3和MCF-7(15.36±2.11、9.25±0.56，均n=4，F=37.261，P=0.000)。见图2。

图2 POSTN蛋白在三种细胞系表达的荧光染色

2.4临床DCIS与IDC病理标本POSTN蛋白质组化结果 对DCIS与IDC病理标本进行POSTN蛋白组化染色发现，IDC标本中的POSTN(1.20±0.40，n=50)显著多于DCIS(1.01±0.50，n=44；t=2.045，P=0.046)。

3 讨 论

乳腺癌是中国女性最常见的癌症之一，并且近年来乳腺癌发病率和死亡率也有明显的上升趋势。高侵袭性乳腺癌由于其易复发，易转移的特点，难以通过手术等常规方法根除，因此早发现早治疗成了提高患者生存率的最有效方法，对于癌细胞的早期诊断技术也是目前研究的热点。目前有文献报道，POSTN在乳腺癌细胞和肿瘤相关纤维母细胞中都有高表达，且在30%～60%的其他类型癌症细胞中也有异常表达〔22，23〕。然而POSTN蛋白表达水平与乳腺癌侵袭性的相互关系却鲜有报道。

POSTN这类糖蛋白被认为是大量表达于细胞外基质，并参与多种生理和病理过程，然而新的研究通过Western印迹和免疫组化技术，发现相对于正常细胞，POSTN在癌细胞的细胞核内和细胞质中也有高表达〔24，25〕。同时POSTN的表达与癌症细胞的淋巴结转移程度呈正相关关系〔17〕。这提示我们胞内POSTN的表达可以很好地作为检测乳腺癌水平的诊断标志。

本实验在小鼠上的实验也证明高表达POSTN的肿瘤细胞的转移风险更大，肿瘤恶化概率更高〔25〕，证明了POSTN与肿瘤细胞转移之间的联系。同时我们临床DCIS与IDC病理标本也证明了，在侵袭性强的IDC乳腺癌标本中，POSTN的表达显著高于DCIS标本。类似的临床研究显示，伴有淋巴转移的乳腺癌患者的外泌体中，POSTN的含量显著高于未发现转移的患者，并且POSTN高表达的患者的生存率低于POSTN低表达患者〔26〕。这些结果提示，POSTN的表达是与乳腺癌发展程度相关的，并且可以作为衡量其发展程度的生物学标志。

综上，POSTN在乳腺癌细胞中的表达程度与乳腺癌细胞的侵袭性相关，高侵袭性的乳腺癌细胞中的POSTN表达含量明显增多，并且离体细胞系的结果与临床病理标本的结果一致。但POSTN在高侵袭性乳腺癌细胞中表达上调的机制不完全清楚，仍需进一步研究验证。