胃腺癌患者肿瘤组织中免疫细胞浸润的生物信息学分析

曾静媛 李炜 梁雨 何诚成 罗玉娇 赵文静 罗波 毛樱逾 郑小莉

(西南医科大学 1护理学院，四川 泸州 646000；2基础医学院；3德阳市中江县人民医院急诊科；西南医科大学 4临床医学院；5教务处·高教研究所)

胃癌位居2018年中国癌症发病率第三位，仅次于肺癌和乳腺癌〔1〕。其发病与饮食习惯、Hp感染、机体免疫功能、种族、地理环境有关〔2〕。胃腺癌是胃癌最常见的组织类型，由于胃腺癌的发病机制目前尚不十分清楚，因此对胃腺癌的早期诊断率也仍较低〔3〕。胃腺癌的预后与其病理分期、组织类型〔4〕、生物学行为以及治疗措施有关〔5〕。

肿瘤是机体正常细胞恶变而来，特点是不断增殖并在体内转移。肿瘤细胞分泌或细胞溶解后产生的一些物质，称为“新抗原”，可招募免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。这是目前肿瘤免疫治疗方法之一〔6〕，如：单克隆抗体免疫检查点抑制剂(PD1/PDL1)治疗胃癌。本研究中，我们从肿瘤免疫微环境(TIME)角度出发〔7〕，通过生物信息学方法，分析22种免疫细胞在正常组织和肿瘤组织中浸润的差异〔8〕，试图找到胃腺癌患者肿瘤组织中浸润的关键免疫细胞。

基因表达汇编(GEO)数据库中有分析正常组织与肿瘤组织差异表达的基因芯片，下载数据表后，利用Perl语言将探针转换成基因后进行数据矫正，转换为矩阵，再通过CIBERSORT软件反卷积法计算肿瘤组织和正常组织中22种免疫细胞的组成情况并量化特定免疫细胞的丰度值〔9〕。Perl软件处理的矩阵再次转换为样本与免疫细胞的矩阵，R软件进行分析并找出胃腺癌组织中浸润的关键免疫细胞，Graziosi等〔10〕研究表明肿瘤组织中浸润的免疫细胞与临床预后密切相关。

1 材料和方法

1.1材料 基因芯片数据。从(GEO)数据库下载GSE79973 Series Matrix File样本数据、GPL570测序的平台文件——〔HG-U133-Plus-2〕Affymetrix HumanGenome U133 Plus 2.0 Array。GSE79973样本数据分析了10例胃腺癌患者的肿瘤组织和正常组织共计20个样本的基因表达数据。10个胃腺癌患者正常组织：GSM2109533、GSM2109535、GSM2 109537、GSM2109539、GSM2109541、GSM2109543、GSM2109545、GSM2109547、GSM2109549、GSM210 9551；10个癌症组织：GSM2109532、GSM2109534、GSM2109536、GSM2109538、GSM2109540、GSM210 9542、GSM2109544、GSM2109546、GSM2109548、GS M2109550。

1.2数据处理 用Perl软件将Series Matrix File和GPL570平台中样本和探针数据整理成矩阵。探针矩阵转换为行名是基因、列名是样本的基因矩阵，基因矩阵中样本信息分为正常组织和肿瘤组织两组。采用R语言Limma程序包再对矩阵进行数据矫正，获得适合CIBERSORT软件分析的矩阵信息。CIBERSORT软件通过反卷积算法，可以基于标准化的基因表达数据来计算复杂组织中免疫细胞组成〔11〕，该方法能量化特定免疫细胞类型的比例。用CIBERSORT软件对矫正后矩阵数据进行分析，原理是把输入基因矩阵信息转换为免疫细胞的矩阵。所得到的矩阵行名是22种免疫细胞、列名是样本信息的矩阵数据。用R(3.5.1版本)和Bioconductor程序包对免疫细胞矩阵数据进行统计学分析。用t检验分析肿瘤组织中相关免疫细胞浸润的差异，所有统计分析，P<0.05认为有统计学意义。在R语言里安装barplot、pheatmap、corrplot、vioplot、ggplot2程序包分别对CIBERSORT结果绘制柱状图、热图、相关性热图、小提琴图、成对差异分析和主成分分析图。

2 结 果

2.1数据筛选 从GEO数据库下载GSE79973的GPL570平台数据、样品矩阵数据、样本信息数据，通过Perl语言、CIBERSORT软件将数据整理成样本与免疫细胞的矩阵数据。按P<0.05进行数据筛选，对20例样本数据分析，除了单核细胞在正常和肿瘤组织中表达都为零，其余21种免疫细胞在肿瘤组织中存在表达差异。

2.2免疫细胞矩阵分析 在R语言中，用barplot函数绘制柱状图。未活化的CD4记忆性T细胞、活化的自然杀伤(NK)细胞、记忆性B细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞在胃腺癌的正常组织中高表达；初始CD4 T细胞、活化的NK细胞在胃腺癌的肿瘤组织中高表达，见图1。

图1 22种免疫细胞在正常组织和胃腺癌癌症组织的表达

在R软件中安装pheatmap程序包。对免疫细胞与样品的矩阵数据绘制热图：未活化的CD4记忆性T细胞、γδT细胞在胃腺癌正常组织中含量高，M0巨噬细胞在胃腺癌肿瘤组织中表达相对较高，见图2。

10例正常样本(con组-蓝色)，10例胃腺癌样本(treat组-粉红色)高表达(红色)低表达(绿色)图2 22种免疫细胞在20个样本中表达

在R软件中安装corrplot程序包，绘制相关热图：在同一样品中，M1巨噬细胞与活化的CD4记忆T细胞相关系数最高，为0.74。即在同一样品中M1巨噬细胞和CD4记忆T细胞表达呈正相关，如M1巨噬细胞含量高，则活化的CD4记忆T细胞含量也高。而在同一样品中，活化的肥大细胞与未活化的肥大细胞表达值最低，为-0.73。即在同一样品中未活化的肥大细胞和活化的肥大细胞表达呈负相关，如未活化的肥大细胞含量低，而活化的肥大细胞含量高，见图3。

高表达(红色)、低表达(蓝色)图3 在同一样品中，22种免疫细胞表达相关热图

在R软件中安装vioplot程序包绘制小提琴图。记忆性B细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、未活化的CD4记忆性T细胞在正常组织中高表达；初始CD4 T细胞、活化的NK细胞在肿瘤组织中高表达，见图4。

图4 免疫细胞在正常组织和胃腺癌癌症组织中表达

2.3成对分析及主成分分析 在R软件中自定义成对分析函数，对同一例患者正常组织和肿瘤组织做成对比较，分析在这两种组织中某一免疫细胞的表达是否具有差异，仍采用t检验分析，差异有统计学意义(P<0.05)。在胃腺癌的正常的组织中，记忆性B细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、未活化的CD4记忆性T细胞表达较高；在肿瘤组织中初始CD4 T细胞、活化的NK细胞表达较高(P<0.05)，见图5。

图5 成对分析

在R软件中安装ggplot2程序包，对正常组织和肿瘤组织做主成分分析(PCA)。PCA是一种统计方法，通过正交变量将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关变量，转换后的这组变量叫做主成分。PCA结果显示：该免疫细胞浸润分析能够很好地区分正常组织与肿瘤组织，见图6。

图6 主成分分析

3 讨 论

在体液免疫中，吞噬细胞对入侵机体的抗原进行摄取和处理，呈递给T淋巴细胞，T淋巴细胞分泌淋巴因子刺激B淋巴细胞增殖和分化产生浆细胞、记忆性B细胞。记忆性B细胞对抗原具有特异性的识别能力，当抗原第二次感染机体时，记忆性B细胞转化为浆细胞的过程比原来更迅速〔12〕。嗜酸性粒细胞具有移行至有病原体和发生过敏反应的部位，该细胞具有能吞噬抗原抗体复合物，释放多种溶酶体酶有杀菌作用。未活化的CD4记忆性T细胞不具有细胞免疫的功能，但有刺激时，可迅速转化为具有活性的CD4记忆性T细胞〔13〕。在本研究中，胃腺癌患者正常组织中记忆性B细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、未活化的CD4记忆性T细胞表达较高，表明在正常组织中，这四种免疫细胞能及时清除抗原，减少肿瘤发生或浸润，对机体具有保护作用，在防御功能方面具有重要作用〔14〕。

活化的NK细胞在白细胞介素(IL)-2刺激下可发生增殖反应，并产生干扰素(IFN)-γ，认为NK细胞与T细胞在发育上关系密切〔15〕。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，作用靶细胞后杀伤活性出现较早的特性，肿瘤发生时，NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞，在肿瘤微环境中表达增高〔16，17〕。

CD4 T细胞可转化为Th0细胞，Th0细胞在细胞因子如IL-12、IL-2和IFN-γ作用下可转化为Th1细胞，后者在白细胞介素-2和IFN-γ刺激下可辅助CTL细胞(细胞毒性T细胞)活化，Th1和CTL 细胞在机体参加细胞免疫；TH0细胞在细胞因子IL-4作用下转化为Th2细胞，细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13能促进Th2细胞的增殖，进而辅助B细胞活化，发挥体液免疫的作用；Th0细胞在细胞因子IL-6，TGF-β刺激下可向Th17细胞转化，在细胞因子IL-17作用下参与固有免疫反应〔18〕，在肿瘤微环境中，缺血、缺氧或肿瘤生长过快、营养不良引起肿瘤坏死物、凋亡的肿瘤细胞、细胞免疫产生的坏死物引起无菌性炎症，Th17细胞参与的人体固有免疫反应在这方面也具有重要意义。在我们这项研究中，胃腺癌肿瘤组织中浸润的CD4 T细胞高表达，在Th0细胞向Th1、CTL、Th17 细胞转化具有重要意义，发挥着积极地抗肿瘤作用〔19〕。

我们的研究还发现，同一样本中，M1巨噬细胞与活化的CD4记忆T细胞表达成正相关。即M1巨噬细胞高表达，则活化的CD4记忆T细胞也就高表达。M1巨噬细胞在细胞因子如IL-1β、TNF、IL-12、IL-18作用下吞噬能力增强，在人体固有免疫防御或反应中有重要意义；而活化的CD4记忆T细胞有记忆特异性抗原刺激的作用，一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协调免疫反应〔20〕。

综上所述：胃腺癌肿瘤免疫细胞浸润生物信息学研究，胃腺癌组织中初始CD4 T细胞、活化的NK细胞表达增高，具有研究价值，进一步的实验验证将是我们下一步研究的重点，如：增大临床胃腺癌组织样本，流式细胞仪测定初始CD4 T细胞、活化的NK细胞数量，CCK8检测胃腺癌患者肿瘤组织中初始CD4 T细胞、活化的NK细胞这两种免疫细胞的增殖功能。

记忆性B细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞、未活化的CD4记忆性T细胞在正常组织中表达高于胃腺癌组织，发挥着积极的固有免疫防御反应。在Svensson等〔21〕的一项关于胃腺癌T淋巴细胞和NK细胞浸润预后的研究中表明，肿瘤浸润的T淋巴细胞抗肿瘤作用在很大程度上依赖于T淋巴细胞和B淋巴细胞或浆细胞之间的功能相互作用。而初始CD4 T细胞、活化的NK细胞在肿瘤组织中表达增高，表明这两种免疫细胞在对肿瘤细胞杀伤和吞噬也发挥积极的细胞免疫和固有免疫。Oberg等〔22〕在研究her2(+)阳性的胃癌患者中，肿瘤中浸润的T淋巴细胞和NK细胞增加了杀伤肿瘤细胞的细胞毒性作用。肿瘤的发生与肿瘤细胞的免疫逃脱、免疫监视机制有关；在免疫微环境中免疫细胞与肿瘤细胞“攻-防”系统失去平衡，导致肿瘤细胞进一步生长、发生侵袭和转移〔23〕。Kelly〔24〕在胃癌免疫治疗研究中，提到免疫细胞治疗肿瘤具有重要意义。免疫微环境中，我们关于免疫细胞浸润肿瘤组织的研究将有助于推动免疫细胞治疗肿瘤这个方向的发展，筛选出在肿瘤组织中浸润增多的初始CD4 T细胞、活化的NK细胞可以为治疗胃腺癌提供新的靶标。