miR-224在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制

张浩 王拥军 桑敬伟 张文 杨卫兵 高雁卿 张紫机

(1安阳市人民医院骨科，河南 安阳 455000；2中山大学第一附属医院关节外科)

骨髓间充质干细胞(hBMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定环境下可诱导分化成为成骨细胞，调控骨的生长发育。因hBMSCs具有来源广泛、易分离培养和分化潜能大等特点，被认为是治疗骨质疏松等骨组织损伤修复的理想种子细胞〔1〕。然而，如何使hBMSCs单向成骨分化一直是制约临床修复效率的关键。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA，可与相关靶基因3′UTR区结合抑制其翻译进而影响细胞的增殖、凋亡和分化等多种生物学过程。研究〔2～4〕证实，miRNA在hBMSCs成骨分化过程中发挥着重要作用。有学者发现，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中低表达，但其具体的作用及调控机制尚不清楚〔5〕。因此，本研究通过体外培养hBMSCs并诱导其成骨分化后，采用常规生物学手段上调miR-224表达，观察其对hBMSCs成骨分化的影响，并通过靶基因预测软件预测相关靶基因，探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人hBMSCs、诱导成骨分化的DMEM培养液、hBMSCs培养液ORICellTM和Opti-MEM培养液购自中国赛业生物公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司。成骨特异性转录因子(Runx)2、骨钙素(OCN)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、SMAD同源物(Smad4)一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自英国Abcam公司。miR-224模拟物(mimics)、miR-control、Smad4 siRNA干扰序列和阴性对照序列均购自上海吉凯公司，脂质体2000购于美国Introvigen公司。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Omega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、逆转录试剂盒、RNA抽提试剂盒和电化学发光(ECL)检测试剂盒购自上海碧云天公司，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒购自南京建成生物公司。双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2hBMSCs培养 采用ORICellTM培养液将hBMSCs培养在含5%CO2的37℃恒温培养箱中，每3 d换1次培养基。待细胞几乎铺满培养瓶底时，加入0.25%胰酶消化，以1∶3比例传代。实验使用第5代细胞。

1.3hBMSCs成骨分化的诱导 取6孔板，每孔接种100 μl浓度为105个/ml的hBMSCs，常规条件下培养24 h后，加入由10%胎牛血清、0.2 mmol/L抗坏血酸、1%谷氨酰胺、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-磷酸甘油构成的诱导成骨分化的DMEM培养液，每3 d换液1次的，诱导培养12 d。分别在第0、3、6、9和12 d收集细胞，进行后续实验。

1.4细胞转染 将未分化的hBMSCs以每孔105个细胞接种24孔板，常规条件下培养24 h后，换成无血清的Opti-MEM培养基，采用Lipofectamine 2000转染试剂将miR-224 mimics(终浓度为50 nmol/L)及阴性对照(终浓度为50 nmol/L)转至未分化的hBMSCs中。转染6 h后，换成成骨诱导培养基继续培养。Smad4 siRNA干扰序列和阴性对照序列的转染过程同上。

1.5qRT-PCR检测miR-224表达 RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，逆转录试剂盒反转录合成cDNA。根据由美国Invitrogen公司合成的miR-224引物(上游：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′和下游5′-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′)和U6引物(上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′)进行PCR定量分析，以U6作内参，检测miR-224的表达。

1.6ALP活性检测 收集成骨诱导培养的hBMSCs，采用ALP检测试剂盒检测ALP活性，根据公式：ALP活性=测定管吸光度值/总蛋白克数。

1.7Runx2、OCN和Smad4蛋白检测 收集成骨诱导培养的hBMSCs，磷酸缓冲液洗涤后，以加蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解细胞提取总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度定量后，以4∶1比例将蛋白样品与5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液混合，沸水浴变性后，进行凝胶电泳。待蛋白分离结束后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常温下以含5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h后，加入特异性一抗4℃下孵育过夜，封闭液洗涤后，HRP标记的二抗常温孵育1 h。暗室内加入ECL试剂显影曝光，以GAPDH为内参，检测目的蛋白的表达情况。

1.8荧光素酶实验 由上海吉凯公司构建Smad4 3′-UTR野生型(含Smad4 3′-UTR目的片段)和Smad4 3′-UTR突变型(含Smad4 3′-UTR突变体)质粒。将对数生长期的hBMSCs随机分为野生型Smad4+miR-224 mimics组、野生型Smad4+miR-control组、突变型Smad4+miR-224 mimics组和突变型Smad4+miR-control组，使用Lipofectamine 2000转染miR-224 mimic及Smad4 3′-UTR野生型或突变型，转染48 h后，使用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.9数据分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1hBMSCs的成骨分化能力 成骨诱导培养0、3、6、9和12 d，ALP活性由(0.11±0.02)U/g依次上升为(0.23±0.03)U/g、(0.45±0.03)U/g、(0.67±0.05)U/g和(0.89±0.06)U/g。与0 d相比，随着诱导时间的延长，hBMSCs 的ALP活性显著升高(P<0.05)，且在12 d时达到最大。在0～12 d的5个成骨培养时间点下OCN蛋白的相对表达量分别为0.13±0.02、0.21±0.02、0.28±0.03、0.36±0.02和0.43±0.03；Runx2蛋白的相对表达量分别为0.25±0.02、0.33±0.03、0.39±0.02、0.46±0.03和0.58±0.03。与0 d相比，OCN和Runx2蛋白的表达水平也均随诱导时间的延长而明显升高(P<0.05)。可见，hBMSCs的成骨分化能力良好。见图1。

图1 hBMSCs成骨分化能力的检测

2.2hBMSCs成骨分化过程中miR-224和Smad4的表达 qRT-PCR检测结果显示，miR-224的相对表达水平从0 d的1.00±0.06到第3天降为0.88±0.06，第6天降为0.74±0.05，第9天降为0.55±0.03，至12 d降至最低，为0.43±0.03；可见，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中的表达水平随着时间的延长逐渐降低(P<0.05)；Western印迹法检测结果(图2)显示，在0～12 d的5个成骨培养时间点下，Smad4蛋白的相对表达量(0.26±0.03、0.35±0.02、0.44±0.03、0.53±0.04和0.72±0.05)则随成骨诱导时间的增加而显著升高(P<0.05)。

图2 hBMSCs成骨分化过程中Smad4的表达

2.3上调miR-224表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化 将miR-224 mimics转至hBMSCs后，qRT-PCR检测miR-224的表达水平明显升高(1.00±0.05 vs 5.53±0.12，P<0.05)。同时，ALP活性〔(0.85±0.06)U/g vs (0.37±0.03)U/g，P<0.05〕、OCN蛋白(0.39±0.04 vs 0.15±0.02)和Runx2蛋白(0.52±0.05 vs 0.32±0.03)的表达水平均显著降低(P<0.05)。如图3可见，上调miR-224表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

图3 上调miR-224表达对hBMSCs向成骨细胞分化的影响

2.4miR-224靶向Smad4抑制hBMSCs向成骨细胞分化 以miRGEN软件预测miR-224的靶基因发现，Smad4是miR-224的一个潜在靶基因。miR-224与Smad4有相关的绑定位点〔6〕，见图4A。为了验证miR-224与Smad4间的靶向关系，以Western印迹检测Smad4蛋白表达发现，上调miR-224后Smad4蛋白的表达明显下降(0.68±0.05 vs 0.46±0.03，P<0.05)，见图4B。同时，根据荧光素酶报告实验检测细胞的荧光素酶活性发现，与共转染Smad4突变体和miR-224阴性对照相比，共转染Smad4突变体和miR-224 mimics细胞的荧光素酶活性无明显改变(1.06±0.08 vs 1.01±0.11，P>0.05)；但是，与共转染Smad4野生型和miR-224阴性对照相比，共转染Smad4野生型和miR-224mimics的细胞荧光素酶活性明显降低(0.57±0.04 vs 0.35±0.02，P<0.05)。可见，miR-224可抑制Smad4的表达，进而抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

图4 miR-224靶向Smad4的作用

2.5下调Smad4的表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化 Smad4 siRNA使细胞中Smad4 蛋白表达显著降低(0.57±0.08 vs 0.26±0.02，P<0.05)；同时发现成骨分化相关蛋白OCN(0.45±0.03 vs 0.29±0.02)和Runx2(0.56±0.04 vs 0.40±0.03)的表达也明显减弱(P<0.05)；此外，ALP活性也从对照的(0.83±0.05)U/g降为(0.52±0.03)U/g，差异显著(P<0.05)。见图5。可见，下调Smad4的表达能够抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

图5 下调Smad4的表达对BMSCs向成骨细胞分化的影响

3 讨 论

miR-224作为miRNAs家族中的重要成员，可通过调控不同的靶基因或信号通路参与细胞的生物学过程。miR-224是一种与肿瘤发生发展关系密切的基因，在多种肿瘤中异常表达，可发挥促癌基因或抑癌基因的作用参与细胞的生物活动。如Wang等〔7〕研究指出，miR-224在非小细胞肺癌患者组织中表达上调，上调其表达可通过靶向调节RAS相关区域蛋白(RASSF)8促进非小细胞肺癌细胞增殖；Lin等〔8〕发现，miR-224在前列腺癌组织中低表达，上调其表达可通过下调Tribbles同源蛋白(TIRB)1抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡。除参与肿瘤细胞的发生发展外，miR-224还参与干细胞的分化。如Na等〔9〕研究发现，miR-224在小鼠的精原干细胞中高表达，可通过靶向Mab-3相关转录因子(DMRT)1表达促进精原干细胞的分化。Choy等〔10〕报道称，小鼠胚胎干细胞神经分化过程中miR-224异常表达，过表达的miR-224通过靶向神经元周期昼夜蛋白-芳基烃受体核转运蛋白-专一蛋白Per-Arnt-Sim(PAS)结构域蛋白(NPAS)4延缓了早期神经分化。hBMSCs是骨组织工程中的重要种子细胞，深入研究其定向成骨分化的机制对提高干细胞修复组织缺损具有重要意义。有学者〔5〕发现，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中低表达，但其具体的作用及调控机制尚不清楚。OCN和Runx2是成骨分化的的标志蛋白，ALP活性是反映成骨活性和成骨能力的量化衡量标准〔11，12〕。本研究结果提示miR-224在成骨分化中发挥着重要的负向调控作用。

基因在机体内的调控网络是一个庞大而又复杂的过程，同一个miRNA可调控多个靶基因，参与细胞的生理过程，发挥不同的作用。Chen等〔13〕指出，miR-224通过靶向白细胞分化抗原(CD40L)参与调节氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的树突细胞成熟过程和促炎性细胞因子分泌；而Liu等〔14〕发现miR-224可通过靶向调控酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)和乙醛脱氢酶(ALDH)2基因参与乳腺上皮细胞凋亡和三酰甘油产生。同时，一个靶基因又受到多个miRNA的共同调控，发挥不同的功效。如Lee等〔15〕研究证实，miR-431通过靶向Smad4促进老年骨骼肌的分化和再生；Zhang等〔16〕发现，miR-146b-5p可通过直接靶向Smad4促进多能干细胞的神经转化；同时，Anderson等〔17〕在软骨细胞形成过程中发现，miR-483可靶向Smad4抑制人hBMSCs向软骨细胞分化。李钧等〔18〕在非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化过程中发现，miR-125b可靶向Smad4参与骨髓基质干细胞成骨分化与增殖。

肿瘤生长因子(TGF)-β是骨代谢过程中重要的转化因子，其在间质干细胞成骨分化过程中发挥着重要的促进作用〔19,20〕，Smad4作为Smad家族中的重要成员，可将TGF-β信号转致胞核，发挥转录因子的功能，参与间质干细胞成骨分化过程〔21,22〕。提示miR-224可负向调控Smad4参与hBMSCs成骨分化。同时，荧光素酶报告实验进一步证实了Smad4是miR-224靶基因。证实了miR-224是通过靶向Smad4抑制了hBMSCs成骨分化。但Smad4对hBMSCs成骨分化的抑制作用明显低于miR-224。猜测，miR-224可能还通过其他途径参与hBMSCs成骨分化过程。

综上，miR-224通过靶向Smad4抑制hBMSCs成骨分化。这一结果为miR-224和Smad4有望成为治疗骨折愈合和骨质疏松等骨骼疾病的药物靶点提供了参考依据。同时，miR-224除了通过靶向Smad4调控hBMSCs成骨分化外，可能还存在其他的调控机制，还需进一步研究。