记忆性B细胞体外扩增影响因素的研究进展①

张莉芳 廖焕金 蔡 珺 何一鸣 彭艳霞 李光民 谢 彤 吴 平 刘华锋 潘庆军

(广东医学院附属医院临床医学研究中心,湛江524001)

记忆性B细胞体外扩增影响因素的研究进展①

张莉芳 廖焕金②蔡 珺③何一鸣④彭艳霞③李光民③谢 彤④吴 平 刘华锋③潘庆军③

(广东医学院附属医院临床医学研究中心,湛江524001)

记忆性B细胞(Memory B cells)是成熟的初始B细胞被抗原激活分化为具有记忆功能并持续存在于宿主的一类细胞。当再次遇到相同抗原时，该细胞可迅速增殖分化为浆细胞，产生高亲和力的抗原特异性抗体，介导体液免疫应答，从而保护机体免受再次入侵的抗原感染[1,2]。

记忆性B细胞在机体体液免疫应答和疫苗开发中具有重要作用。通过对记忆性B细胞的研究，不仅能加深人们对记忆性B细胞生理特性和免疫记忆的认识，而且能推动疫苗的设计开发，以及为体外生产大量抗体提供理论依据。然而，由于记忆性B细胞在外周血中的数量较少，并且没有一种精确检测和分离的方法，导致人们对记忆性B细胞的生理特性和再次参与免疫应答的研究滞后[3]。因此，探索体外检测、活化和扩增记忆性B细胞的方法至关重要。本文就记忆性B细胞在体外检测、活化及扩增的影响因素作简要综述。

1 记忆性B细胞

记忆性B细胞被定义为：在入侵的抗原被清除后，接触过抗原并持续存在于宿主中的一类细胞，当再次遇到相同抗原时，该细胞能快速应答产生高亲和力的抗原特异性抗体，介导体液免疫应答[1,2]。人记忆性B细胞主要分为两类[4,5]：①免疫球蛋白转换的记忆性B细胞 (CD27+IgD-IgG+/IgA+/IgE+)；②非转换IgM+记忆性B细胞，包括CD27+IgM+IgD-和CD27+IgM+IgD+的细胞亚群。虽然近期研究发现一群不表达CD27的B细胞也具有记忆性B细胞的特性[6]，但是，大家仍普遍认为肿瘤坏死因子受体家族成员CD27可作为人记忆性B细胞的表面标记物[7]。

抗体的产生和抗体记忆是体液免疫的基本功能。在感染或接种疫苗后，基于B细胞表达的B细胞受体(B cell receptor,BCR)对外来抗原的识别，成熟的初始B细胞被激活并分化为记忆性B细胞和浆细胞，从而使机体具有免疫记忆功能[8,9]。维持机体免疫记忆的细胞主要是长寿命浆细胞和记忆性B细胞。长寿命浆细胞定居于骨髓中，持续分泌抗体，中和入侵的病原微生物，执行免疫保护功能；记忆性B细胞则主要循环于外周血或定居于次级淋巴组织和骨髓中[10,11]。研究发现，当机体再次接触相同抗原时，IgG+B细胞可快速被活化并增殖分化为产生高滴度、高亲和力的IgG抗体分泌型细胞，以便能更有效清除入侵的病原体[8,12]。此外，在抵抗细菌和病毒入侵时，记忆性B细胞除了分化为浆细胞产生抗体外，还可通过产生细胞因子或提呈抗原给T细胞，从而影响免疫性疾病的进展[13]。

2 记忆性B细胞体外检测方法的研究进展

传统上，血清抗体滴度的检测是反映机体疫苗接种后体液免疫应答能力的最常用方法，主要是此方法简单，成本低。目前，市场上的绝大多数疫苗的免疫力都可通过抗体滴度来检测[2,14,15]。然而，长期的体液免疫记忆不仅依靠长寿命浆细胞产生的抗体，同时也依赖于记忆性B细胞再次暴露在抗原时快速分化为浆细胞的能力[3]。也可通过检测记忆性B细胞的种类和数量来确定体液免疫应答的强度和范围[16]。所以，即使血清抗体滴度的检测结果为阴性，记忆性B细胞也可能大量存在，不过只是处于静息状态[15]。单独检测免疫后血清的抗体滴度不足以反映机体的免疫记忆能力[17]，如果联合检测抗体和记忆性B细胞的水平就更能体现人B细胞介导的免疫应答能力。

目前，记忆性B细胞的检测方法主要有两种：①采取荧光素标记的单体或四聚体抗原直接与记忆性B细胞结合，再通过多色流式细胞仪检测，即可检测出记忆性B细胞的数量和种类[18,19]；②体外用多克隆刺激剂预刺激记忆性B细胞，培养一定时间，待其分化为抗体分泌细胞(Antibody-secreting cells,ASC)后，通过酶联免疫斑点试验(Enzyme-linked immunospot,ELISPOT)或酶联免疫吸附试验检测ASC分泌抗体的数量，从而达到对记忆性B细胞检测的目的[20,21]。但是，由于记忆性B细胞在外周血中的数量较少，约占人外周血B细胞的30%～40%[5]，尚且无精确检测和分离记忆性B细胞的有效方法。

1983年，ELISPOT实验第一次用于检测B细胞，发现可以识别分泌IgG的B细胞[22]。研究发现ELISPOT试验是检测记忆性B细胞和浆细胞的重要方法。存在于外周血中的浆细胞不用体外预活化，通过ELISPOT试验即可检测出来，但只有在抗原入侵或免疫后的特定时间才可检测到[23]。记忆性B细胞则需预刺激5～6 d[21]，甚至更长时间[5]，待其激活分化为ASC后才能在ELISPOT板上检测到。刺激时间的长短，主要与刺激剂、细胞活化潜能和细胞的纯度(如PBMC、B细胞或提纯的记忆性B细胞)有关[23]。目前，ELISPOT试验不仅能评估记忆性B细胞分泌的抗体是否发生类别的转换，而且能评估记忆性B细胞在外周循环的数量，现已广泛运用于疫苗接种学、肿瘤免疫治疗学和移植免疫学等领域[24]。

3 记忆性B细胞体外活化方案

如何活化记忆性B细胞是在体外研究其生理特性时首先要解决的问题。因此，为精确评估记忆性B细胞的功能特性，探索快速有效的B细胞活化方案至关重要。

初始B细胞活化的经典途径涉及到B细胞与抗原特异性结合以及抗原特异性T、B淋巴细胞相互识别的过程[25]。但鉴于记忆性B细胞的功能特性与初始B细胞不同，两者可能存在不同的活化方式。因此，研究者开始探索非抗原依赖的记忆性B细胞活化方案。研究发现，用非抗原依赖的多克隆刺激剂与其他刺激物联合使用，能使大部分记忆性B细胞分化为ASC[26]。此外，Crotty等[21]联合使用PWM(Pokeweed mitogen,PWM)+CpG (Cytosine-phosphate-guanine,CpG)+SAC(Staphylococcus aureus Cowan,SAC)于体外培养6 d，可以使抗原特异性记忆性B细胞(Antigen-specific memory B cell)分化为ASC。2014年，Huang等[27]联合使用SAC、CpG和PWM刺激记忆性B细胞，通过ELISPOT试验检测，发现记忆性B细胞能分化为ASC，并产生大量抗体，表明在体外通过非抗原依赖的多克隆刺激，记忆性B细胞能分化为ASC。

随着研究的深入，研究者们发现联合使用多克隆刺激剂如CpG、PWM、SAC与CD40L或细胞因子IL-2 和IL-10等刺激记忆性B细胞，能更有效地让其活化。Dugas等[28]用CD40-CD154体外培养系统发现，来源于持续性多克隆B淋巴细胞增多症(Persistent polyclonal B cell lymphocytosis,PPBL) 的记忆性B细胞可大量增殖并分泌IgM和IgG，表明通过CD40可活化记忆性B细胞，使其增殖。同年，Ghamlouch等[5]联合使用CpG、CD40L、IL-2、IL-10 和IL-15与来源于慢性B淋巴细胞白血病的记忆性B细胞共培养7 d，发现记忆性B细胞能分化为ASC，并分泌大量的IgM。此外，Karahan等[24]联合使用α-CD40单克隆抗体、ODN-2006(Oligodeoxy-nuc-leotides(ODN)-2006)、CpG、IL-2、IL-10和IL-21与记忆性B细胞共培养，发现记忆性B细胞可活化增殖并分化为ASC，认为该刺激方案可有效激活记忆性B细胞。

目前，研究者提出联合使用R848(TLR7和TLR8激动剂)和IL-2才是刺激记忆性B细胞活化的最有效方案。2009年，Pinna等[29]评估记忆性B细胞的活化方案时，发现联合使用R848和IL-2刺激记忆性B细胞6天后的活化效果，优于联合使用PWM、CpG和SAC。2013年，Jahnmatz等[23]通过对多种刺激B细胞活化的方案进行对比发现，联合使用R848+IL-2预刺激72 h后，能最有效地使记忆性B细胞活化增殖并分泌IgG。与其他方案相比，该方案可提高检测抗原特异性记忆性B细胞的灵敏度。同年，Walsh等[30]联合使用R848+IL-2刺激记忆性B细胞5 d后，亦可诱导HIV特异性的记忆性B细胞分化为ASC。如今，联合使用R848和IL-2刺激记忆性B细胞活化的方案已逐渐被众多实验室认可。

虽然已有多种方案能使记忆性B细胞活化并增殖，但记忆性B细胞是如何接受环境信号刺激以及其非特异性多克隆激活的规律仍无确切结论，有待深入研究。

4 活化扩增抗原特异性记忆性B细胞的方法

随着检测方法和记忆性B细胞活化方案的优化，目前已有多种方案能使外周血中的记忆性B细胞分化为ASC并产生相关抗体。但是，这种活化方式是一种非特异性多克隆激活，分泌的是多克隆抗体。于是，研究者开始探索如何从众多活化的记忆性B细胞中筛选出针对某种抗原的抗原特异性记忆性B细胞。

目前，最常用的方法是通过疫苗诱导产生抗原特异性记忆性B细胞，再通过体外多克隆刺激剂使其活化扩增，在ELISPOT板上筛选获得针对这种疫苗的抗原特异性记忆性B细胞。2004年，Crotty等[21]联合应用PWM、CpG和SAC刺激从炭疽疫苗接种者中分离出的记忆性B细胞，在ELISPOT实验中检测发现炭疽特异性记忆性B细胞能分化为ASC，分泌保护性抗体，并证明该记忆性B细胞属于IgG+亚群。2011年，Morris等[31]从HIV-1疫苗接种者外周血中分离出单个B细胞，克隆得到能识别HIV-1gp41保守位点及能中和多株HIV-1的抗体，并认为在HIV-1gp41包被蛋白的C端存在多免疫原性靶点，可为单个B细胞抗体制备技术及疫苗设计提供依据。此外，Buisman等[26]在研究疫苗诱导的抗原特异性的记忆性B细胞应答时，发现每毫升血液中约有10个抗原特异性记忆性B细胞，并由此推算人的机体约有6×104个抗原特异性记忆性B细胞。

近年，联合应用ELISPOT试验方法和多克隆刺激剂，相继检测出了HIV特异性记忆性B细胞、恶性疟原虫特异性记忆性B细胞，Ro/SSA-和La/SSB特异性记忆性B细胞[31-33]等。随着检测方法和活化方案的优化，必将会有越来越多的抗原特异性记忆性B细胞被检测出来，为疫苗的设计及开发提供理论依据。

5 体外检测、活化及扩增记忆性B细胞的意义

免疫记忆是免疫系统中最显著的特点。无论体液免疫或细胞免疫，再次应答都具有迅速、强烈、特异性高和持久的特点[34]。但记忆性B细胞是如何接受环境信号刺激以及其非特异性多克隆激活的机制尚不明确。因此，通过体外检测、活化和扩增记忆性B细胞，不但能加深人们对记忆性B细胞功能特性和免疫记忆功能的认识，使深入研究人体免疫记忆功能和机理成为可能，为体外制备全人源性抗体提供相关理论依据。

在疫苗领域，体外检测、活化及扩增记忆性B细胞对疫苗的设计开发具有重要意义[15]。检测记忆性B细胞的应答可评估疫苗的效能，并可筛选出对感染性疾病或癌症免疫治疗的疫苗无反应的风险群体[20，32]。同时，从免疫或感染个体中分离出的抗体有助于我们分析该疫苗诱导产生的抗体类型、生理功能并指导相关疫苗的设计和开发[15]。因此，检测外周记忆性B细胞的应答能力可为我们评估疫苗的疗效及疫苗对人体的保护时间提供相关理论依据[35]。

体外扩增记忆性B细胞制备抗体技术是一种潜在制备全人源性抗体的方法。目前，实验技术尚不能通过体外细胞培养获得大量的人多克隆抗体，而临床上运用的治疗性免疫球蛋白多克隆制剂或静脉注射的免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulins，IVIg)是志愿者的血浆中分离出来的，其主要成分为IgG，因其来源途径的限制，导致IVIg相当紧缺[36]。因此，通过体外检测、活化和扩增记忆性B细胞有望在体外产生大量的全人源性多克隆抗体，以增加IVIg的来源。研究发现，利用多克隆刺激剂可诱导人记忆性B细胞向浆细胞转换，分泌大量的多克隆抗体，并证明了该抗体与正常人血清的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4功能结构相似[37]。此外，扩增的记忆性B细胞也可结合单个B细胞抗体技术，生产混合的人单克隆抗体。研究表明单个B细胞抗体技术制备的单克隆抗体，具有全人源性、自身高度特异性和均一性的特点，在治疗病原微生物感染、肿瘤、自身免疫性疾病及器官移植等方面有独特的优势和良好的应用前景[34]。

综上，通过体外活化和扩增记忆性B细胞，不仅有助于对记忆性B细胞功能特性及免疫记忆功能的认识，而且为人工构建亲和力和特异性更高的抗体提供理论依据，将推动免疫学在医学预防、治疗等方面的应用与发展。

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[收稿2016-02-19 修回2016-03-09]

(编辑 许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.031

①本文受国家自然科学基金(81471530)、广东省自然科学基金(2015A030313526)和广东省卫生厅医学科研基金(A2014481)资助。

张莉芳(1990年-)，女，在读硕士，主要从事自身免疫性疾病发病机制研究。

及指导教师：吴 平(1962年-)，男，博士，主任技师，主要从事风湿免疫性疾病发病机制研究，E-mail：wpin62@126.com。 潘庆军(1978年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事自身免疫性疾病防治研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0144-04

②并列第一作者。

③广东医学院附属医院肾脏疾病研究所，湛江524001。

④广东医学院附属医院风湿免疫科，湛江524001。