北京艾蒿叶斑病菌的分子鉴定和室内毒力测定

王伟青,董 杰,岳 瑾,杨新建

（1.北京农业职业学院，北京 102442；2.北京市植物保护站，北京 100029）

0 引言

艾蒿(Artemisia argyi)是一种用途广、经济效益好的药用植物，通过种植艾蒿可以实现种植业与药用、保健、旅游等多个产业的融合发展，符合北京都市现代农业的发展定位，也有助于推动贫困村脱贫致富[1]。国内对艾蒿的研究主要集中在品种、栽培和药理学等方面，对艾蒿病害防治技术研究较少。北京市部分基地开展了艾蒿种植工作，但是种植品种存在产量不高、适应性不强等问题，同时在种植过程中也遇到了一系列植物保护问题急需解决[2]。

本试验对艾蒿叶片具有典型叶斑病病斑的病原菌进行了分离，并利用ITS对所获得的序列进行分析，从而快速、有效地鉴定出致病的真菌。另外，为了筛选出有效防治艾蒿叶斑病的适应性药剂，本研究选择市场上使用广泛的真菌病害杀菌剂进行室内毒力测定，以期筛选出对该病菌具有抑制作用的杀菌剂，为艾蒿病害的田间防治提供参考[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

供试艾蒿病害样本取自北京市延庆区艾蒿种植基地，供试艾蒿品种分别为湖南衡阳艾、河南南阳艾、河南食用艾三个适合北京地区引种的艾蒿品种。

1.2 试剂

50%多菌灵可湿性粉剂（江阴市农药二厂有限公司）；50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂（又称露娜森，德国拜耳作物科学公司、杜邦中国有限公司）；25%戊唑醇悬浮剂（青岛星牌作物科学有限公司）；75%百菌清可湿性粉剂（南京利民化工股份有限公司）；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；70%代森锰锌可湿性粉剂（河北贺森化工有限公司）；Marker DL5000（南京诺维赞生物科技有限公司）；PDA培养基（北京路桥技术有限公司）；DNA提取试剂盒（上海生工有限公司）；PCR试剂盒（上海生工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分离

采用常规组织分离法分离病原菌[4]。在超净工作台上将带有病害症状的艾蒿叶片在病害部位切下长宽约5 mm的叶组织，用75%的酒精浸泡20 s进行表面消毒，接着将其浸泡于0.2%次氯酸钠中，摇动使其充分接触消毒液，消毒1 min，用无菌水冲洗3遍，放置于无菌滤纸上，吸干表面水分，然后将叶组织平放在加有50 mg/mL氯霉素的PDA培养基上面，正面放置1 min后，放置于28℃恒温培养箱内进行倒置培养，培养3～5 d[5]。

1.3.2 病原菌的DNA提取和ITS-PCR扩增

将1.3.1中PDA平板上的病原菌株放置在28℃培养箱中培养5～7 d，在无菌条件下收集菌丝100 mg，提取病原菌基因组DNA（参照上海生工真菌DNA提取试剂盒的说明书），利用真核生物的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，其中ITS1和ITS4引物的序列分别为（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR（50μL 反应体系）条件如下：加入2倍Pfu-PCR MIX（PCR Buffer，Taq DNA聚合酶，dNTP） 25 μL，引物TS1 2μL，引物ITS4 2 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序：95℃预变性 3 min，94℃变性30 s，55℃ 30 s，72℃延伸60 s，35个循环，72℃最终延伸5 min，产物4℃保存。PCR产物送到上海生工有限公司进行测序，测序结果在NCBI网站上利用BLAST工具进行序列比对，选取比对结果中同源性98%以上的序列进行同源性分析并用MEGA 7.0软件构建系统发育树[5]。

1.3.3 5 种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法进行室内毒性试验[6]。在熔化的18 mL PDA培养基（冷却至45℃）中加入用无菌水配制的10倍药剂浓度（表1）的供试药剂2 mL，制成含有不同浓度的药剂培养基。摇匀后，迅速将培养基倒入无菌培养皿中，以同体积无菌水的无药PDA平板为对照，等待培养基凝固。用打孔器切取直径为6 mm的病原菌片放到培养基的中间（菌丝面朝下放置），每个平板1片，每次重复3次。在28℃恒温培养箱中培养5～7 d后，用交叉法进行菌落直径测定。并计算不同杀菌剂对菌丝生长的抑制率，杀菌剂的抑制率按照下面的公式进行，分析比较不同杀菌剂对菌丝生长的影响[7]。

表1 室内毒力试验中杀菌剂的药剂浓度

杀菌剂对叶斑病菌抑制率按下面公式[8]计算：

根据抑制率概率转换表格对所求的抑制率换算成抑制机率值。以各杀菌剂的浓度的对数作为横坐标，以药剂抑制机率值为纵坐标，进行回归直线方程的制作，从而得到5种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌的毒力回归方程，根据回归方程计算出EC50（有效浓度）和相关系数R值。

2 结果与分析

2.1 艾蒿叶片叶斑病菌的ITS-PCR扩增和序列分析

对艾蒿叶斑病菌的样品分离出其中的1株菌株（编号WWQYQ20004-1-1）提取基因组DNA，并进行PCR扩增，对ITS-PCR的产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，艾蒿叶斑病菌ITS-PCR产物大小片段500～750 bp左右（如图1）。PCR产物进行测序表明，片段大为571 bp，将测序结果在NCBI上用BLAST软件进行序列比对分析，发现其与Alternaria alternata（KJ002058.1）和Alternaria alternata（MN856408.1），Alternaria alternata（MN589744.1），Alternaria alternata（MN856409.1）同源性达99%（图2），通过MEGA 7.0的CLUS-TALW进行多序列比对并构建ML系统发育树，如图3所示，可以确定WWQYQ20004-1-1号菌株为链格孢属（Alternaria alternata）。

图1 PCR产物电泳图

图2 艾蒿叶斑病菌在NCBI上用BLAST软件进行序列比对图

图3 艾蒿叶斑病菌及其近缘真菌rDNA ITS序列系统发育树

2.2 杀菌剂对艾蒿叶斑病菌菌丝生长的室内毒力测定

供试杀菌剂对艾蒿叶片叶斑病菌的室内毒力测定结果见表2。由表2可见，5种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌均有一定的抑制效果，且抑制率均随药剂浓度的增大而增强。5种供试药剂75%百菌清、70%甲基硫菌灵、50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂、25%戊唑醇、70%代森锰锌在药剂浓度依次为200.00 mg/mL、120.00 mg/mL、100.00 mg/mL、100.00 mg/mL、500.00 mg/mL时，对艾蒿叶斑病菌的抑菌率最大，分别为64.50%、52.83%、96.50%、96.17%、68.83%。抑菌率最高的药剂是50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和25%戊唑醇药剂。

表2 不同供试药剂各浓度对艾蒿叶斑病病原菌的抑制效果

5种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌的毒力回归方 程，回归系数和EC50值的结果见表3。

表3 5种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌的室内毒力回归方程

从表3可看出，不同杀菌剂对艾蒿叶斑病菌的EC50值差异较大，艾蒿叶斑病菌对50%氟吡菌酰胺·肟菌酯和25%戊唑醇EC50值最小，分别是0.04 mg/mL和0.28 mg/mL，说明这两种药剂对艾蒿叶斑病菌的抑菌性最强；艾蒿叶斑病菌对百菌清，甲基硫菌灵和代森锰锌的EC50值分别为31.02mg/mL、78.24mg/mL和70.28mg/mL，说明艾蒿叶斑病菌对百菌清、甲基硫菌灵和代森锰锌产生较强的抗药性，其中，对代森锰锌和甲基硫菌灵的抗性最大，也说明二者抑菌效果最差。

3 结论与讨论

在北京市延庆区的艾蒿叶片上发现叶斑病害，发病典型症状为叶面有褐色斑点。通过组织分离的方法从病害部位分离真菌菌株，结合ITS扩增和序列分析，对其进行鉴定。结果表明，从艾蒿中分离、鉴定出来的优势真菌菌株属链格孢属（Alternaria alternata）[9]，链格孢属真菌属有丝分裂孢子真菌类群丝孢纲丝孢目，是引起植物病害的重要真菌类群之一。叶斑病常危害叶部，多发生在夏季多雨时节，受害叶片产生黄褐色病斑，严重时整个叶片变成灰褐色，枯萎而死。该病从开始发病到发病高峰期病程短，发病迅猛，毁灭性强，若防治不当或不及时，有可能造成艾蒿种植园的毁灭。目前，叶斑病的防治主要还是依赖链格孢化学药剂[10]，尚未有防治艾草叶斑病的化学药剂的登记记录，而室内敏感性测定结果可以为田间防治提供一定参考。本研究选用了5种高效低毒的杀菌剂对分离的艾蒿叶斑病菌进行室内毒力测定，从结果可以看出，5种杀菌剂对艾蒿叶斑病菌均有一定的抑制效果，且抑制率均随药剂的浓度的增大而增强，其中50%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂和25%戊唑醇药剂的杀菌效果最好。戊唑醇是一种三唑类杀菌剂，通过阻碍真菌麦角甾醇的生物合成引起真菌细胞膜的破环和细胞死亡，对多种农作物病害具有良好的防治效果；氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂是拜耳作物科学公司开发的药剂，是一种高效、低毒、内吸性广谱杀菌剂[10]。杀菌剂的室内毒力测定是病原菌药剂选择的重要依据，此两种药剂是否可作为田间药剂试验首选，可以进一步做田间试验进行论证。