响应面法优化柿子多糖脱蛋白质工艺研究

王 辉，句荣辉，王 丽，朱建晨

（北京农业职业学院，北京 102442）

0 前言

柿子隶属柿科(Ebenaceae),是我国五大水果(柿子、葡萄、柑桔、香蕉、苹果)之一，具有较为广泛的产地，在我国山东、江苏、河北等地均有产出，功效有润肺、解毒等。其柿皮中含类胡萝卜素、维生素C等多种微量元素以及大量的多糖。在最近的研究当中，人们开始发掘柿子的保健价值，充分发挥其药用功效。

在植物界当中，多糖属于一种天然成分，有良好的抗氧化功效，能够有效提高人体的免疫力，进而起到抗肿瘤的效果。在实际研究中，我们发现柿子具有较高含量的多糖，通过传统的水提法对其进行多糖提炼有较大缺陷，得到的粗多糖纯度不够理想，不利于多糖的功效发挥。如何去除蛋白质，是对多糖提纯的重要步骤，也是制备多糖相关纯品的关键环节[1]。

经过反复的试验验证发现,木瓜蛋白酶能够起到良好纯化效果，同时能更好地将柿子中的多糖保存下来[2]。在本文的试验中，采用了响应面对上述除杂方法进行优化，不仅有效提高了蛋白质脱除率，还可以对多糖相关的食品进行开发，提高柿子的利用率，并打下良好的试验基础[3-4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原材料

柿子果实购买于北京市房山区青龙镇地区。

1.1.2 试验试剂

本次试验使用到的试剂均是纯化学试剂，包括浓硫酸、乙醇等在内；水则采用了二级蒸馏水。

1.2 仪器与设备

具体情况见表1。

表1 实验主要仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 柿子多糖提取工艺

柿子洗净、去皮、去籽→烘干(65℃，48 h)→粉碎、过筛(65目=0.25 mg)→称重→固液比(1∶10)→无水乙醇(20 mL)→振荡、混匀→超声辅助热水浸提(80℃，1 h)→离心(4 000 r/min，10 min)→取除液体→醇沉(80%乙醇10 mL，24 h)→离心→水溶液、定容(100 mL)→粗多糖溶液→酶解（单因素及多因素）→灭酶→离心(4 000 r/min，10 min)→对多糖及蛋白质进行测定。

1.3.2 多糖含量的测定

根据所得数据对曲线进行绘制，挑选充分干燥后的柿子0.01 g，放置到容器中，定容到100 mL，从而制备出试验所需的葡萄糖溶液，溶液的浓度为0.1 mg/mL。吸取5组不同剂量的葡萄糖标准溶液放入试管当中，分别为 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，通过加入蒸馏水进行补充，让各组溶液补充至1.0 mL，然后加入1mL的5%苯酚，之后快速将5 mL的浓硫酸加入到各组溶液当中，随后放置10 min，再进行1 min的搅拌操作，均匀后置入水浴锅20 min，水浴锅温度控制在30℃，然后在490 nm处进行吸光度的测量[5]。得到回归方程为：

1.3.3 蛋白质含量的测定

绘制标准曲线：吸取牛血清白蛋白标准溶液，溶液浓度为0.1 mg/mL，吸取的溶液量分别是 0、 0.03 mL、 0.06 mL、 0.12 mL、0.24 mL、0.48 mL、0.72 mL、0.84 mL、0.96 mL，依次置于9组比色管中，然后向各组管中补充去离子水到1 mL，并进行摇匀操作。然后准备考马斯亮蓝溶液，向每组试管倒入5 mL，摇匀后放置2 min，在595 nm波长处进行吸光度的测定[6]。得到回归方程为：

1.3.4 计算方法

1.3.4.1 多糖含量的测定

按苯酚—硫酸法测定多糖含量。

1.3.4.2 蛋白质含量的测定

按考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

1.3.5 脱蛋白质单因素试验

木瓜蛋白酶法脱蛋白质单因素试验为：酶解温度分成4个，分别是40 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃，酶用量分成6组，分别是0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%，酶解时间为6组，分别是0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，同时以多糖保留率作为指标，探究各因素对柿子粉多糖保留率白质和蛋脱除率的影响。

1.3.6 响应面优化试验

在完成单因素试验之后，将各个因素设定为自变量，按照Box-Behnken设计原理，利用Design-Expert V 8.0对试验进行设计。其中，响应值设定为蛋白脱除率与多糖保留率，然后对其进行全面的试验和分析，得出的试验因素和水平如表2所示。

表2 木瓜蛋白酶脱蛋白质试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 酶解单因素对蛋白质脱除率的影响

2.1.1 酶用量对蛋白质脱除率的影响

将温度控制在45℃，试验的时长为2 h，根据用量的不同，将木瓜蛋白酶共分为6组，分别是0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%，在这个条件下对酶用量的造成影响进行分析，结果如图1所示。

图1 木瓜蛋白酶用量对多糖保留率和蛋白质脱除率的影响

由图1可见，酶的添加量越多，多糖保留率在一定范围内会逐渐上升，并在2%呈现出最大值，但酶用量超过2%后，则出现下降趋势。这是由于酶浓度超过一定值后，底物与酶产生更多的接触机会，使蛋白质脱除的效率得到增强。部分多糖会产生水解作用，蛋白质的脱除率慢慢提高之后，多糖也会出现部分的损失，损失量有限[7]。当酶添加量达到2%时，蛋白质脱除率比较高，达到了98.11%，而在2.5%时多糖保留率会降到最低。这是由于该用量条件下，导致多糖产生大量水解而致。在用量达到3%时，蛋白质脱除率则最小，而多糖保留率不断提高，这是由于酶已将蛋白质脱除完成，留存的酶进一步发挥催化作用，并将柿子粉中的多糖继续溶出，造成多糖保留率增高。因此，选取2%为最佳的酶用量。

2.1.2 酶解温度对蛋白质脱除率的影响

保持酶用量为2%不变，处理时间为2 h，酶解温度分为5组，分别是40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，对不同温度条件下多糖的保留率进行分析，结果如图2所示。40℃～50℃，温度越高，多糖保留率也越高，在50℃时，多糖保留率最为理想，达到了89.81%，同时蛋白质脱除率提高。在该温度区间内，酶的活性得到激活，温度越高，其活性越强，反应速度得到提高。但酶解温度超过50℃之后，温度越高，多糖保留率越低，蛋白质脱除率下降。这是由于超过酶的最适温度后，酶出现失活的现象，使得多糖保留率和蛋白质脱除率均下降，不符合试验目的，所以本试验中50℃是最合适的温度。

图2 酶解温度对多糖保留率和蛋白质脱除率的影响

2.1.3 酶解时间对蛋白质脱除率的影响

控制酶解温度为50℃，用量固定为2%，将酶解时间设为变量，共分为6组，分别是0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，通过试验分析时间对多糖保留率的影响，见图3。

图3 酶解时间对多糖保留率和蛋白质脱除率的影响

由图3可见，0.5 h～1.5 h，随时间延长，多糖保留率呈现提升的状态，蛋白质脱除率也增多。这是由于底物和酶的接触机会得到增多，而脱除率在下降。同时，部分多糖产生水解。在时间达到2 h的时候，蛋白质脱除率达到43.22%。这是因为酶充分活化使蛋白质除去，同时使多糖发生水解，造成多糖的损失[8]。当时间为2.5 h时，多糖保留率达到最大值（87.17%），蛋白质脱除率下降。这是因为柿子粉中蛋白质脱除干净，酶与底物反应将多糖提取出来，因此选取2.5 h为最佳的酶解时间。

2.2 响应面优化酶法提取条件

2.2.1 模型建立与显著性检验

根据各个单因素对试验进行分析，本试验共有3个因素，分别是加酶量、温度与时间，定义为X1、X2、与X3。并设定两个指标，分别是多糖保留率与蛋白质脱除率，定义为Y1、Y2。通过三因素三水平的试验，得出的方案和结果如表3所示。

表3 Box-Behnken设计方案及结果

通过Design-Expert V 8.0对数据进行处理，完成模型的建立，并得到各个单因素的回归方程：

多糖保留率:

蛋白质脱除率:

通过多糖保留率回归方程模型进行方差分析，见表4。

表4 多糖保留率回归方程模型方差分析

由表4可见，失拟项P为0.7096，超过了0.05，说明该模型的拟合度较好，差异不显著，出现的残差可能是小概率的时间。由方差分析可知，校正决定系数R2=0.8060，这表明模型具有较高的解释力度，能对80.06%响应值产生的变化做出解释[9]。在所选取的各因素水平范围内，通过对F值的观察，对因素的影响主次进行排序，得出结果为X3＞X2＞X3。在交互作用的比较上，主次顺序为：X2X3＞ X1X2＞X1X3。

通过蛋白质脱除率回归方程模型进行方差分析，见表5。

表5 蛋白质脱除率回归方程模型方差分析

由表5可见，P＞0.05，表明该模型具有较好的拟合度，出现的残差属于随机误差[10]。通过对其进行方差分析可得R2=0.7588，这表明75.88%响应值的变化都可以得到很好的解释。通过对F值的对比，可以了解各因素的影响次序，分别是X2＞X1＞X2。对各个因素交互作用的主次顺序进行分析，得出结果为：X2X3＞ X1X3＞X1X2。

2.2.2 响应面分析

依据回过方程对响应曲面图进行绘制，对其形状进行检验考察，对各个因素的影响及交互效应进行分析，见图4—图9。

图4 加酶量与酶解温度交互作用对多糖保留率影响的响应面

图5 加酶量与酶解时间交互作用对多糖保留率影响的响应面

图6 酶解温度与酶解时间交互作用对多糖保留率影响的响应面

图7 加酶量与酶解温度交互作用对蛋白质脱除率影响的响应面

图8 加酶量与酶解时间交互作用对蛋白质脱除率影响的响应面

图9 酶解时间与酶解温度交互作用对蛋白质脱除率影响的响应面

从图4—图9可以了解到任意两个因素的编码处于零水平状态时其他变量对多糖保留率及蛋白质脱除率的影响。其中，图5具有最为陡峭的曲面，对保留率而言，时间与加酶量有最强的交互性，而图7、图9的坡度比较缓慢，说明对多糖保留率和蛋白质脱除率而言，温度与加酶量有不错的交互性，对于蛋白质脱除率来说，时间与加酶量有较强的交互性，所得的分析结果与方差分析吻合[11]。

经过上述分析，并结合软件处理所得的数据，其中可获得最佳工艺参数为：加酶量2.0%，酶解温度50℃，酶解时间2.5 h，与实际测量值有所偏差。实际测量得到最佳解温度45℃，酶解时间为3 h，加酶量2.0%，此时多糖保留率最佳，为89.73%，而蛋白质脱除率也较为理想，达到了30.33% ，脱蛋白质工艺条件重复性好。本次试验蛋白质脱除率较低，多糖保留率较高，可能与酶法脱蛋白质数较少有关，可以通过正交试验或其他方法继续探究对综合指数的影响。

3 结论

柿子具有较高的多糖含量，其中1%～10%成分为蔗糖等，其余则是果糖与葡萄糖。以葡萄糖含量为最高，果糖次之。糖的甜度，如以蔗糖为100，则果糖为148，葡萄糖为70。本试验以柿子多糖保留率作为主要分析指标，并将蛋白质脱除率定位为次要分析指标进行了多糖脱蛋白工艺研究。

本试验采用了单因素的试验方法，在此基础上结合软件进行方案设计和数据处理，通过二次回归分析，得到本次试验的最佳条件[12]。试验对加酶量、温度与时间进行综合分析，建立相互之间的回归模型，通过分析得出，该模型可靠性较高，能够将蛋白质脱除率较为准确地预测出来。最优的试验条件为：时间3 h，温度45℃，加酶量2.0%。该方法具有很好的操作性和可行性，处理后的多糖溶液仍然残留部分蛋白质，无法完全去除，这可能是由于一些蛋白质和多糖形成了糖复合物，完成脱蛋白质处理后，多糖结构还有待于进一步研究。