Hsulf-1介导PI3K/AKT信号通路抑制肝癌细胞侵袭转移的作用机制研究

刘凌 沈伟敏 郭琦琪

肝癌（hepatic carcinoma）是我国最常见的恶性肿瘤之一。我国每年因原发性肝癌死亡42.2万例，约占全球50%，其不良预后与早期转移及复发有关，因此研究肝癌的侵袭转移机制至关重要[1-3]。本研究团队在前期研究中发现，肝癌组织中人硫酸酯酶-1（Hsulf-1）mRNA和蛋白表达水平较癌旁组织均明显降低，且在肝癌细胞系HepG2、SMMC7221等中Huslf-1表达较正常细胞系LO2低，提示Hsulf-1与肝癌细胞生长、侵袭转移关系密切，然而Hsulf-1在肝癌细胞侵袭转移中的具体作用机制仍不甚明确[4-5]。此外目前已有大量研究发现磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信号通路与肝癌的发生、发展相关[6-9]。因此本研究将进一步探讨Hsulf-1介导PI3K/AKT信号通路抑制肝癌细胞侵袭转移的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌细胞系SMMC7221细胞购自上海中国科学院细胞库；pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1、Hsulf-1 siRNA质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司。TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；内参GAPDH、上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）基因引物均购自上海生工生物工程有限公司，一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗购自美国马里兰州KPL公司；Trizol试剂、DMEM、G418、FBS、细胞裂解液、LY294002、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、LipofectamineTM2000试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 采用胰蛋白酶消化生长状态良好的SMMC7221细胞，计数后分别接种于24孔细胞培养板上，待细胞生长至70%～80%时，严格按照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明书进行转染，分为Hsulf-1过表达组、Hsulf-1 siRNA组、抑制剂组和空白组。Hsulf-1过表达组：将 pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1质粒转染至SMMC7221细胞中，在细胞培养箱中转染 6 h后更换培养基继续培养；Hsulf-1 siRNA组：成功构建的Hsulf-1 siRNA按照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明书，转染至SMMC7221细胞中；抑制剂组：SMMC7221细胞加入AKT抑制剂LY294002；空白组：培养良好的SMMC7221细胞，不作其他处理。

1.3 E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法，用Trizol试剂提取细胞总RNA，接着测定RNA纯度及含量。根据GeneBank设计引物，后者作为内参照。E-cadherin的上游引物:5′-TGAAGGTGACAG AGCCTCTGGAT-3′，下游引物：5′-TGGGTGAATTCGG GCTTGTT-3′；β-catenin 的上游引物：5′-AAGGTCTGAG GAGCAGCTTC-3′，下游引物：5′-TGGACCATAACTGCA GCCTT-3′；内参照 GAPDH 的上游引物：5′-AGTCAAC GGATTTGGTCGT-3′，下游引物：5′-TTGATTTTGGAGG GATCTG-3′。严格按照 TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0试剂盒操作说明书进行相关步骤操作，最终反应产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，在染色后使用凝胶成像系统进行照相并定量分析。

1.4 Hsulf-1、磷酸化 AKT（p-AKT）、E-cadherin 和 βcatenin蛋白表达水平检测 采用Western blot法。细胞转染24 h后，通过细胞裂解液来裂解细胞，并提取蛋白，采用BCA蛋白定量检测试剂盒测定相关蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后再转印硝酸纤维素薄膜（PVDF）上，在用封闭液稀释一抗后（包括Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin 以及 β-catenin）过夜，PBST漂洗后，再浸洗3次，每次5 min，加入二抗4℃下1 h，漂洗后吸干，应用ECL发光试剂盒进行结果的显影显色，标定Marker后拍照分析，并以β-actin作为内参照。

1.5 细胞迁移能力检测 采用Transwell小室实验法。将转染pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1质粒后的Hsulf-1过表达组、Hsulf-1 siRNA组、抑制剂组（加入10 μmol/L LY294002）以及空白组SMMC7221细胞用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。对数生长期的细胞用2 mol/L乙二胺四乙酸//PBS缓冲液消化，PBS洗涤1次，用无血清0.1%BSADMEM重悬成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml。每孔200 μl细胞悬液均匀接种于上室，下室加入5%FBS-DMEM培养基 500 μl，在 37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养24 h，取出后PBS洗，并用棉签去除上室的表面细胞以及Matrigel凝胶，然后下室细胞使用4%多聚甲醇进行固定，染色后PBS洗两遍，并于光学显微镜下观察，随机选择5个视野计算迁移细胞数平均值。

2 结果

2.1 各组E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平比较 Hsulf-1过表达组E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平均明显高于空白组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA组、抑制剂组 E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平均明显低于空白组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1、图1。

表1 各组E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平比较

图1 各组E-cadherin和β-cateninmRNA表达的电泳图（E-cadherin为上皮钙黏蛋白；β-catenin为β-连环蛋白；a：Hsulf-1 siRNA组；b：抑制剂组；c：空白组；d：Hsulf-1 过表达组）

2.2 各组 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin 蛋白表达水平比较 与空白组比较，Hsulf-1过表达组Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为高，p-AKT均明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA组p-AKT蛋白表达水平明显为高，Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；抑制剂组p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Hsulf-1 siRNA组比较，抑制剂组p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图 2、3。

图2 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白相对表达水平比较（Hsulf-1为人硫酸酯酶-1；p-AKT为磷酸化AKT；E-cadherin为上皮钙黏蛋白；β-catenin为β-连环蛋白；与空白组比较，*P＜0.05；与 Hsulf-1 siRNA 组比较，△P＜0.05）

图3 各组 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin蛋白表达的电泳图（Hsulf-1为人硫酸酯酶-1；p-AKT为磷酸化AKT；E-cadherin为上皮钙黏蛋白；β-catenin为 β-连环蛋白；a：Hsulf-1siRNA 组；b：抑制剂组；c：空白组；d：Hsulf-1 过表达组）

2.3 各组SMMC7221细胞迁移能力比较 与空白组比较，Hsulf-1过表达组、Hsulf-1 siRNA组SMMC7221细胞迁移数均明显为高，抑制剂组SMMC7221细胞迁移数明显为低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与Hsulf-1 siRNA组比较，抑制剂组SMMC7221细胞迁移数明显为低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组SMMC7221细胞迁移情况（个）

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近一半以上肝癌的新发病例发生在我国，具有生长快、转移率及复发率高等特点。因此，研究肝癌发生、发展的相关机制对我国的卫生健康尤为关键。据报道，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）是细胞膜及细胞外基质的重要组成成分，可以通过硫酸化水平调控多种细胞因子信号通路，从而控制细胞的形成、黏附、增殖和分化等多种功能[10-13]，而Hsulf-1基因被认为是HSPGs硫酸化水平的调控因子，其表达异常可通过减少HSPGs的硫化作用，调控相应的细胞因子信号通路，与多种肿瘤的增殖、侵袭转移密切相关，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等。Roy等[14]在对卵巢癌的研究中发现，Hsulf-1集中表达在细胞表面，通过瞬时转染Hsulf-1可显著增加HSPGs中的硫酸葡萄糖胺水平，同时人肝素结合性表皮生长因子及成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）诱导细胞因子的磷酸化水平显著下降，并抑制肿瘤细胞增殖等，调控卵巢癌的发生、发展。在另外一项对头颈部鳞状癌细胞系SCCHN的研究中，结果发现Hsulf-1基因能显著降低FGF-2及肝细胞生长因子（HGF）介导的细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信号通路的活性，抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭力，促进肿瘤细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展密切相关[15-17]。有大量研究显示，PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤发生发展的关键通路，而AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能被PI3K依赖的细胞外信号通路（如与表皮生长因子受体结合）激活，使其蛋白结构活化，处于磷酸化状态[18-20]。被激活的AKT进入细胞，造成细胞内大量底物蛋白磷酸化，最终调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等表型，有研究证实在肝癌中，AKT信号通路与β-catenin相关[21-22]。

而在本研究中，笔者证实在肝癌细胞SMMC7221中，Hsulf-1过表达可抑制PI3K/AKT信号通路，并通过PI3K/AKT信号通路提高转移相关蛋白E-cadherin以及β-catenin的表达。当笔者分别将Hsulf-1表达质粒，Hsulf-1 siRNA质粒转染至肝癌细胞SMMC7221后，AKT磷酸化表达随着Hsulf-1表达增加而减少，而E-cadherin以及β-catenin的表达则明显增加，加入AKT抑制剂后，可发现E-cadherin以及β-catenin的表达明显降低，表明AKT信号通路在Hsulf-1抑制肝癌细胞侵袭转移中起到非常重要的作用。接着，笔者采用Transwell小室实验法检测肝癌SMMC7221细胞在不同处理下的迁移能力，结果显示在Hsulf-1过表达后，肝癌SMMC7221细胞的侵袭能力明显减少，而在加入AKT抑制剂后，Hsulf-1抑制肝癌SMMC7221细胞的侵袭能力则受到一定影响。

综上所述，笔者证实Hsulf-1基因可抑制肝癌的侵袭转移，且进一步阐明了PI3K/AKT信号通路参与肝癌侵袭转移的作用机制，为肝癌转移预防及治疗提供新的方向。