环状RNA hsa_circ_0000301在胃癌组织中的表达及临床意义

李琪儿 邵永富 叶国良

胃癌是人类常见的恶性肿瘤，其全球发病率居所有恶性肿瘤第5位，而死亡率排名则高居第3位，其中我国因胃癌病死人数约占全球一半[1-2]。尽管医学治疗手段在不断发展，但由于大多数患者确诊时已处于晚期，导致胃癌的预后仍很差，5年总体生存率仅27%[3-4]。胃癌是一种在组织和分子水平高度异质性的疾病，其发病机制复杂多样[4]。因此，探索胃癌发生、发展的分子机制、寻找有效的肿瘤标志物以及新的治疗靶点仍是胃癌诊断和治疗的研究热点。

环状RNA是一种普遍存在于真核转录组中的具有基因调控作用的非编码RNA，其具有较高保守性和组织特异性[5]。环状RNA与癌症发生、发展密切相关[6]。相较于其他线性RNA，环状RNA由于其特殊的共价闭环结构而不易被RNA酶所降解，因此具备更高的稳定性[5]，使其成为癌症诊断的潜在新型标志物[7]。目前有学者已经发现一些具有潜在诊断价值的环状RNA，如hsa_circ_002059[8]、hsa_circ_0000096[9]和 hsa_circ_0001895[10]等在胃癌组织中表达下调，hsa_circ_0058246[11]和hsa_circ_102958[12]等则表达上调。Li等[13]通过基因芯片筛选出343个在胃癌患者血浆中表达异常的环状RNA，其中hsa_circ_0000301是表达上调最为明显的环状RNA之一。然而，hsa_circ_0000301在胃癌患者中表达情况尚不明确。本研究进一步探索hsa_circ_0000301在胃癌组织中的表达情况，并结合临床病理因素分析该环状RNA的临床意义。

1 材料和方法

1.1 样本采集 选取2013年1月至2016年12月于宁波大学医学院附属医院经手术切除的96例胃癌患者的癌组织及配对癌旁组织，其中男65例，女31例，年龄27～80（62.3±10.5）岁。根据 hsa_circ_0000301 在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平分为两组：高表达组（癌组织表达水平高于癌旁组织）28例和低表达组（癌组织表达水平低于癌旁组织）68例。所有患者术前均未接受过放化疗及靶向治疗等全身治疗。所有胃癌组织均经病理学检测证实，癌旁组织标本均取自于同一患者的手术切除标本，距离肿瘤边缘超过2 cm，且病理学检测证实为非癌组织。采集的新鲜组织标本立即浸泡于无氮样品保存液中，并放入-80℃冰箱中保存备用。本研究经本院医学伦理委员会批准（2013GZ020），所有患者均已签署知情同意书。

1.2 hsa_circ_0000301表达水平检测 采用RT-qPCR法。采用Trizol（美国Invitrogen公司，批号：260712，100 ml）试剂提取组织标本中总RNA，总RNA浓度采用核酸蛋白分析仪测定，根据A260/A280比值以及用1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳条带完整性鉴定总RNA的质量。将提取的总RNA使用GoScript逆转录试剂盒（美国Promega 公司，批号：0000323588，100 reactions）逆转录成cDNA。以cDNA为模板，采用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒（美国 Promega 公司，批号：0000372782，25 ml）在Mx3005P荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司）上进行RT-qPCR。hsa_circ_0000301的引物序列：正向：5′-AGCAGGAAGGTGTGAGCTGG-3′，反向：5′-TGCCTGCTTACAGCCACTCA-3′；外参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列：正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。扩增条件设定为：95℃5 min预变性，95℃ 30 s变性，60℃1 min退火，72℃30 s延伸，循环45次。每个样本进行2次独立实验取Ct平均值。环状RNA的表达水平采用ΔCt法计算，计算公式为：ΔCt=Ct（hsa_circ_0000301）-Ct（GAPDH）。

1.3 随访 96例患者出院后均进行随访，随访方式为电话随访和门诊随访，随访内容包括一般情况、临床症状、胃镜检查及影像学检查。随访起点为手术日期，末次随访时间为2019年12月31日，至随访截止日，存活66例，病死30例，无失访患者。

1.4 hsa_circ_0000301功能注释 基于circbank[14]数据库分析hsa_circ_0000301结合的miRNA；miRWalk 2.0[15]数据库分析miRNA已知靶向的mRNA；采用Cytoscape 3.8.0构建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA网络图。采用ToppFun[16]数据库对has_circ_0000301潜在调控的mRNA进行信号传导通路和基因本体论（GO）富集。

2 结果

2.1 胃癌和癌旁组织中hsa_circ_0000301表达水平比较 hsa_circ_0000301在胃癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 胃癌和癌旁组织中hsa_circ_0000301表达水平比较（**P＜0.01；ΔCt值越大，表达水平越低）

2.2 不同临床特征胃癌患者的hsa_circ_0000301表达水平比较 见表1。进一步分析hsa_circ_0000301的表达水平与胃癌患者不同临床特征的关系，结果显示，发生胃癌远处转移、复发以及癌胚抗原阳性患者hsa_circ_0000301表达水平均明显升高（均P＜0.05）。

表1 不同临床特征胃癌患者hsa_circ_0000301表达水平比较

2.3 不同hsa_circ_0000301表达水平胃癌患者生存比较 低表达组患者总生存期（HR=0.285，95%CI：0.107～0.757，P＜0.05）以及无病生存期（HR=0.375，95%CI：0.173～0.812，P＜0.05）均明显短于高表达组，见图 2。

图2 不同hsa_circ_0000301表达水平胃癌患者的生存曲线比较（a：总生存期比较；b：无病生存期比较）

2.4 hsa_circ_0000301对胃癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示hsa_circ_0000301诊断胃癌的AUC为0.672，且当截断值为8.57时，其灵敏度为0.72，特异度为 0.62，见图 3。

图3 hsa_circ_0000301诊断胃癌的ROC曲线

2.5 Hsa_circ_0000301潜在功能分析 通过构建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA调控网络显示，hsa_circ_0000301作为hsa-miR-1178-3p和hsa-miR-362-3p的分子海绵，可分别间接调控下游211个和106个靶基因表达，见图4a。对下游靶基因通路和GO富集进一步分析发现hsa_circ_0000301具有多种生物学功能，其中包括具有调控JNK、Wnt等与胃癌发生密切相关的信号传导通路的潜能，见图4b-c。

图4 hsa_circ_0000301潜在功能分析（a：hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA调控网络；b：hsa_circ_0000301下游信号传导通路；c：hsa_circ_0000301基因本体论富集）

3 讨论

我国为胃癌高发地区，胃癌的发病率居恶性肿瘤第2位[17]。目前胃癌的诊断主要依靠胃镜检查，而我国是人口大国，医疗资源有限，胃镜检查作为一种有创检查耗时、耗力，因此并不是筛查、随访的最佳手段，与之相比肿瘤标志物检查则更为方便，但现有的肿瘤标志物如糖类抗原（CA）19-9和癌胚抗原（CEA）对胃癌检测的灵敏度和特异度均不理想[18]，因此人们致力于探索新型的分子标志物。环状RNA作为一种非编码RNA，因其稳定性高且表达具有组织特异性，而被认为是理想的分子标志物。研究表明hsa_circ_002059和hsa_circ_0000096等具有胃癌诊断价值。本研究结果发现hsa_circ_0000301在胃癌组织中的表达较配对的癌旁组织明显降低，ROC曲线分析hsa_circ_0000301诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为0.72和0.62，而目前传统的肿瘤标志物CEA和CA199-的灵敏度仅分别为0.30和0.42[19]。因此，hsa_circ_0000301有望成为理想的诊断胃癌的标志物。

进一步结合临床病理因素分析，发现hsa_circ_0000 301表达水平越低，越容易出现远处转移、越容易复发、且越容易出现组织CEA阳性，这可能是导致hsa_circ_0000301低表达组的总生存期以及无病生存期均明显短于高表达组的原因。此外，环状RNA常作为“miRNA海绵”竞争结合miRNA，进而间接调控下游靶基因表达[19]。基于该理论，本研究团队构建了hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA调控网络，分析发现hsa_circ_0000301可能通过调控JNK[20]、Wnt信号传导通路[21]等影响胃癌的恶性表型和不良预后。

而Li等[13]通过基因芯片检测，发现hsa_circ_0000301在胃癌患者血浆中的表达显著上调，这与本研究中胃癌组织的结果相反。本研究团队推测hsa_circ_0000301可能通过外泌体等形式大量释放进入血液，从而导致组织中低表达血浆中高表达。

本研究证实了hsa_circ_0000301作为胃癌相关环状RNA，其在胃癌组织中表达下调，且其表达下调与胃癌患者的不良预后相关。hsa_circ_0000301具有成为胃癌标志物的潜力，其作用机制尚需进一步研究。