芹菜素调控PTCH1/GLI1/Bcl-2轴对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响

潘岩 刘鲁明 花永强

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，因其隐匿起病、高度恶性，且缺乏明显的临床表现，85%的患者在发病确诊时已属于癌症终末期，5年生存率低于7%[1]。Sonic Hedgehog信号通路在胰腺肿瘤的形成发展、浸润转移、肿瘤多药耐药等过程中发挥重大作用[2]，靶向调控GLI1转录因子可改善患者临床预后[3]。芹菜素作为一种天然黄酮物质，普遍存在于食用蔬菜和水果中，研究证明其可通过调控肿瘤相关基因、诱导细胞凋亡、调节信号通路传导、阻断肿瘤血管形成、放化疗增敏及化学预防等多种途径发挥抗肿瘤作用[4-5]。有研究报道芹菜素对胰腺癌有明显的抑制作用[5-7]，但其作用机制尚不明确。本研究以PTCH1/GLI1/Bcl-2轴为切入点，探索芹菜素对胰腺癌细胞增殖和细胞凋亡的影响及其潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人胰腺癌BxPC-3细胞、SW1990细胞均为复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科刘鲁明教授惠赠。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI1640购自美国Hyclon公司；FBS试剂购自美国Gibco公司；青、链霉素双抗购自德国Sigma公司；体外增殖检测试剂盒（CCK-8）购自日本本同仁化学研究所；细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自加拿大Fermentas公司；PTCH1、GLI1、Bcl-2和GAPDH引物均由上海生物工程技术有限公司合成；兔抗人PTCH1、GLI1、actin均购自美国 Cell Signalling Technology公司；山羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司；BD FACalibur System流式细胞分析仪均购自美国BD公司；基因扩增仪购自德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将人胰腺癌BxPC-3细胞、SW1990细胞接种于含10%FBS、1%青、链霉素的RPMI 1640培养基中[8]，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，当细胞融合达75%左右时，1∶3传代。

1.3.2 细胞活力检测 采用CCK-8法。将制成单细胞悬液的胰腺癌BxPC-3、SW1990细胞以 1×103个/孔接种于96孔板（100 μl/孔）。将芹菜素用0.1%DMSO溶解，并制备成浓度梯度的芹菜素溶液（2、5、10、20、40、60、80 μmol/L）。上述细胞培养24 h后加入0.1%DMSO及浓度梯度的芹菜素进行干预24、48和72 h。检测细胞活力时每孔加入CCK-8溶液10 μl，培养1 h后用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值，计算细胞活力。使用graphpad prism软件计算BxPC-3、SW1990细胞经芹菜素干预48 h后的半数抑制浓度（IC50）。

1.3.3 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书，通过胰蛋白酶消化获取的胰腺癌BxPC-3、SW1990 细胞，用 PBS 洗涤，加入 195 μl Annexin V-FITC结合液，常温避光处理10 min后加入10 μl PI染色液，冰浴避光放置，随即用流式细胞仪进行检测。

1.3.4 细胞克隆形成率检测 采用平板克隆实验。将制成单细胞悬液的胰腺癌BxPC-3、SW1990细胞以5×102个/孔接种于6孔板（1 ml/孔），待细胞贴壁生长后分别加入 0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 的芹菜素干预 14 d。镜下观察5个视野，计数克隆形成数目并拍照，取平均值，计算克隆形成率。克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.3.5 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相对表达量检测 采用RT-PCR法。BxPC-3、SW1990细胞经0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 芹菜素干预 48 h。参考前期研究[9]提取细胞总RNA，采用RT-PCR试剂盒检测PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相对表达量。根据SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明反应体系20 μl，反应条件：94℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环。PTCH1引物：上游：5′-CGGCGTTCTCAATGGGCTGGTTTT-3′，下游：5′-GTGGGGCTGCTGTTTCGGGTTCG-3′；GLI1 引物：上游：5′-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3′，下游：5′-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3′；Bcl-2 引物：上游：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′，下游：5′-CCGG TTCAGGTACTCAGTCA-3′；GAPDH 引物：上游：5′-CA AGG TCATCCATGACAACTTTG-3′，下游：5′-GTCCACCA CCCTGTTGCTGTAG-3′。最终mRNA的相对表达量使用2-ΔΔCt法定量。

1.3.6 PTCH1、GLI1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。参考前期研究描述的方法，用RIPA裂解液裂解细胞，进行蛋白提取，BCA法检测蛋白浓度[9]。取等量蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离样品；将蛋白电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，与一抗4℃孵育过夜。缓冲液洗膜（15 min×3次）后将膜与二抗室温孵育2 h，化学发光法检测蛋白表达丰度。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 8组BxPC-3、SW1990细胞活力比较 与 0.1%DMSO 组比较，2、5、10、20、40、60、80 μmol/L 芹菜素组24、48、72 h时的IC50均明显降低，且呈剂量及时间依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1。

图1 8组BxPC-3、SW1990细胞活力比较（a：BxPC-3细胞；b：SW1990细胞）

2.2 4组BxPC-3、SW1990细胞凋亡率比较 与0.1%DMSO 组比较，10、20、50 μmol/L 芹菜素组 BxPC-3、SW1990细胞凋亡率均明显升高，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1、图2。

图2 4组 BxPC-3、SW1990细胞凋亡率的流式细胞图（a：BxPC-3细胞；b：SW1990细胞）

表1 4组BxPC-3、SW1990细胞凋亡率比较（%）

2.3 4组BxPC-3、SW1990细胞克隆形成率比较 与0.1%DMSO 组比较，10、20、50 μmol/L 芹菜素组 BxPC-3、SW1990细胞克隆形成率均明显下降，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2、图3（插页）。

图3 4组BxPC-3、SW1990细胞克隆形成率比较（a：BxPC-3细胞；b：SW1990细胞）

表2 4组BxPC-3、SW1990细胞克隆形成率比较（%）

2.4 4 组 BxPC-3、SW1990 细胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相对表达量比较 与0.1%DMSO组比较，10、20、50 μmol/L 芹菜素组 BxPC-3、SW1990 细胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显下调，差异均有统计学意义（均 P＜0.01），见表 3～5。

表3 4组BxPC-3、SW1990细胞PTCH1 mRNA相对表达量比较

表4 4组BxPC-3、SW1990细胞GLI1 mRNA相对表达量比较

表5 4组BxPC-3、SW1990细胞Bcl-2 mRNA相对表达量比较

2.5 4组BxPC-3、SW1990细胞PTCH1、GLI1蛋白表达水平比较 与0.1%DMSO组比较，10、20、50 μmol/L芹菜素组BxPC-3、SW1990细胞 PTCH1、GLI1蛋白表达水平均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 6～7、图 4。

图4 4组 BxPC-3、SW1990细胞PTCH1、GLI1蛋白表达的电泳图（a：BxPC-3细胞；b：SW1990细胞）

表6 4组BxPC-3、SW1990细胞PTCH1蛋白表达水平比较

表7 4组BxPC-3、SW1990细胞GLI1蛋白表达水平比较

3 讨论

芹菜素是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，在众多实体肿瘤中发挥抗肿瘤作用[5]，这一作用主要通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬来实现[10]。在前列腺癌中，Shukla等[11]发现芹菜素可以通过下调NF-κB激酶抑制剂和NF-κB信号通路来抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。胆管癌HcCCA-1细胞经芹菜素干预24、48、72 h后，细胞生长受抑，细胞凋亡率显著增加，且这种作用呈剂量和时间相关性[12]。本文探索了芹菜素对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响，结果提示不同浓度芹菜素对胰腺癌细胞系BxPC-3和SW1990的细胞增殖有不同程度的抑制作用，对细胞凋亡有不同程度的强化作用，芹菜素干预剂量越大、干预时间越长，作用越明显。这一结果与前期报道的芹菜素干预胰腺癌细胞系AsPc-1、Panc-1和MiaPaCa-2的实验结果一致[6]。

Sonic Hedgehog信号通路异常活化与胰腺恶性肿瘤形成发展关系密切。PTCH1、GLI1在胰腺肿瘤组织中的表达显著高于正常胰腺组织[13]。GLI1转录因子表达与TNM分期、神经浸润、淋巴管转移有关，与分化程度和肿瘤大小无关。GLI1高表达预示着胰腺癌更差的生存预后[14]。因此，Sonic Hedgehog信号通路，尤其GLI1可能是胰腺癌的潜在治疗靶点。本研究采用RT-PCR和Western blot法证实了 20 μmol/L 和 50 μmol/L 浓度的芹菜素可以显著降低胰腺癌BxPC-3和SW1990细胞中PTCH1、GLI1在基因和蛋白水平的表达，且两者表达变化一致，变化趋势与肿瘤细胞增殖受抑正性相关，与细胞凋亡增加呈负相关。Slusarz等[15]在前列腺癌的研究中发表了相似的研究结果：芹菜素通过降低Hedgehog信号通路中的转录因子GLI1相对表达量来抑制前列腺癌细胞在体外和小鼠体内的生长。

Bcl-2基因是一种抗凋亡因子，参与细胞凋亡。有研究表明芹菜素可通过减少抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白的比值从而诱导脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡，使更多的肿瘤细胞阻滞在G2/M期[16]。本研究进一步发现胰腺癌BxPC-3和SW1990细胞经10、20、50 μmol/L芹菜素干预后，肿瘤细胞凋亡比例呈剂量依赖性显著性增加，Bcl-2相对表达量逐渐下降，两者呈负相关。有趣的是，Bcl-2是GLI1基因的下游靶基因，当GLI1被激活后进入细胞核，诱导下游靶基因Bcl-2、PTHC1等的表达，最终致使胰腺肿瘤细胞增殖受抑、细胞凋亡增加。

综上所述，本研究结果提示，芹菜素对胰腺癌细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用与下调PTCH1/GLI1/Bcl-2轴有关。