红花S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析

谭政委 李 磊 余永亮 许兰杰 杨红旗 董 薇马新明 梁慧珍

(1河南省农业科学院芝麻研究中心，河南 郑州 450002；2河南农业大学信息与管理科学学院，河南 郑州 450002)

S－腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS，EC:2.5.1.6)是植物代谢过程中的一个关键酶，它能催化ATP 和甲硫氨酸反应生成S－腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)[1]。SAM是主要的甲基供体以及乙烯、多胺、生物素生物合成的前体[2－4]。另外，SAM 还具有转氨丙基[5]、转硫[6]的作用。乙烯、多胺在植物体内参与了多种生物和非生物胁迫响应过程[7－8]。研究表明，高盐[9]、干旱[10－11]、高温[12]、低温[13]等多种非生物胁迫都能诱导SAMS基因表达上调，并通过过量表达SAMS提高转基因植物对低温和干旱的耐受性[14]。

红花(Carthamus tinctoriusL.)，别名红蓝花、刺红花、草红花，是菊科红花属一年生双子叶草本植物，是集油用、药用和工业用于一体的特种经济作物，在世界各地广泛栽培，在我国已有2 000 多年的栽培历史[15]。红花有很强的耐寒、抗旱、耐盐碱、耐贫瘠等不良环境条件的特性[16]。红花适应性强，种植范围广，全世界每年种植红花约110 万公顷。我国是红花种植大国，年种植面积3～4 万公顷，主要分布在新疆、云南、四川、河南等地[17]。目前已从玉米(Zea maysL.)[18]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[19]、紫花苜蓿(Medicago truncatulasubsp. falcata)[14]、蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)[20]等植物中克隆得到了SAMS基因并对其相关功能进行了初步研究，但红花SAMS基因的克隆、表达及其在植物逆境胁迫中的作用尚鲜见报道。本研究通过分析NCBI 数据库比对红花高通量转录组数据，利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 技术在红花中克隆SAMS基因的cDNA 全长，命名为CtSAMS1，对其序列进行生物学信息分析，通过qRT-PCR 技术分析其在不同组织、不同发育时期的表达差异，并研究其在盐、干旱、低温胁迫和外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)、水杨酸(salicylic acid，SA)、脱落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellin 3，GA3)处理下的表达情况，探究CtSAMS1 在逆境胁迫和激素处理下的响应机制，以期为深入研究CtSAMS1 的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

豫红花1 号品种(由河南省农业科学院芝麻研究所选育)种植于河南省农业科学院现代农业研究开发基地大田中，自然条件下长至开花期，选取5～10 株在开花第1 天的顶果球红花花冠连同分枝一起剪下，放入1/2 浓度的Hoagland 标准营养液中，移至光照培养箱中，培养条件为26±1℃、16 h/8 h(光照/黑暗)，培养24 h 后，分别经NaCl(200 mmol·L－1)、 低温(4℃)、聚乙二醇6000(polythylene glycol 6000，PEG 6000)(20%)3 种非生物胁迫及MeJA(100 μmol·L－1)、SA(150 μmol·L－1)、ABA(150 μmol·L－1)和GA3(150 μmol·L－1)4 种外源激素处理，每个处理3 次重复，处理0、3、6、12、24 h 后采集红花花瓣，并立即置入液氮中保存，转移至－80℃超低温冰箱中保存，用于总RNA 提取。

选取大田中自然生长状态一致的豫红花1 号顶果球，在花冠从总苞片中露出的第1(S1 期)、第3(S2 期)、第5(S3 期)、第7 天(S4 期)取样，为减小试验误差，将采集不同植株的不带子房的花冠均匀混合，每个时间点取3 个重复，将采集的红花花冠立即置入液氮中保存，转移至－80℃超低温冰箱中保存，用于总RNA 提取。

1.2 红花CtSAMS1 基因全长的克隆

按照北京华越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 试剂盒说明书提取盛花期红花花冠的总RNA，采用M-MLV 反转录酶试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录合成单链cDNA，用DNAMAN 软件设计引物(表1)，进行CtSAMS1 基因核心片段克隆，PCR 扩增体系为20 μL，含10×buffer 2 μL，上下游引物(10 μmol·L－1)各1 μL，dNTP(2 mmol·L－1)2 μL，cDNA 模板1 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR 扩增程序为: 95℃变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃终延伸10 min。回收目的片段，连接到pMD19-T 载体上，转入大肠杆菌DH5α，进行测序。根据测序结果设计3′端、 5′ 端引物(表1)，按美国 Clontech 公 司SMARTTM RACE Amplification Kit 说明书，扩增得到3′端、5′端目的片段，将目的片段回收并连入pMD19-T载体 上，转入大肠杆菌DH5α，进行测序。通过DNAMAN 软件拼接出CtSAMS1 基因全长序列，根据全长序列设计引物(表1)，进行CtSAMS1 基因全长克隆，通过测序鉴定全长序列是否与拼接结果一致。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 红花CtSAMS1 生物信息学分析

CtSAMS1 蛋白的氨基酸组成、蛋白质分子质量、理论等电点及稳定性等参数分析通过在线软件ProtParam tool 完成；通过ExPASy 中的SOPMA 工具对CtSAMS1蛋白的二级结构进行分析；采用SWISS-MODEL 在线软件预测CtSAMS1 蛋白的三级结构；通过TMHMM Server v2.0 对CtSAMS1 蛋白的跨膜结构域进行分析；CtSAMS1蛋白保守区预测采用NCBI 的蛋白保守区数据库(conserved domain database，CDD)完成；以CtSAMS1 蛋白序列为模板，通过NCBI 数据库Blast P 查找CtSAMS1的同源氨基酸列，找出其他物种中CtSAMS1 蛋白的同源序列，利用DNAMAN 对CtSAMS1 蛋白与其他物种的SAMS1 同源蛋白的同源性进行分析；通过MEGA 7.0 软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建CtSAMS1 蛋白系统进化树，并通过Bootstrap 方法对进化树进行检测，Bootstrap 值设置为1 000。

1.4 红花CtSAMS1 基因在不同组织和不同胁迫时间的表达分析

按照北京华越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 试剂盒说明书提取不同非生物胁迫和不同激素处理的样品的总RNA，按照天根生物科技北京有限公司的Fast Quant RT Super Mix 说明书进行逆转录反应，根据CtSAMS1 基因全长序列设计qRT-PCR 引物，以Ct60s作为内参基因，引物序列如表1 所示，用天根生物科技北京有限公司的Super Real Pre Mix(SYBR Green)试剂盒进行qRT-PCR 反应，扩增体系20 μL:2×SuperReal Pre Mix 10 μL、上游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、下游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、cDNA 模板5 μL、ddH2O 3 μL。qRT-PCR 反应程序:95℃变性20 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s，扩增45 个循环，于荧光定量PCR 仪(德国Eppendorf Mastercycler ep Realplex 2.2 Detection System)上进行。相对定量分析采用2－ΔΔCt方法。

2 结果与分析

2.1 红花CtSAMS1 基因全长cDNA 的克隆

以拟南芥SAMS2(GenBank 登录号:NP_001078345)氨基酸序列为参考序列，通过BLAST 与NCBI 中的红花转录组数据比对，扩增获得红花CtSAMS的核心片段(图1-A)，根据核心片段序列设计特异引物，进行3′-RACE 和5′-RACE 扩增(图1-B)，测序结果表明，3′-RACE 和5′-RACE 扩增片段均匀核心片段序列有重叠区域，将扩增片段通过DNAMAN 软件进行组装，通过NCBI 中的ORF Finder 模块对CtSAMS的开放阅读框进行预测，然后根据开放阅读框序列设计全长引物，进行PCR 扩增，扩增结果如图1-D 所示，扩增序列的全长为1 173 bp，编码390 个氨基酸，测序结果与拼接结果一致，将该基因命名为CtSAMS1。

2.2 CtSAMS1 的生物学信息分析

2.2.1 CtSAMS1 理化性质分析、亚细胞定位、跨膜区域预测 通过ExPASy 中的ProtParam tool 对CtSAMS1基因编码蛋白的理化性状进行预测。CtSAMS1 编码的蛋白相对分子质量为42 677.42，理论等电点为5.64，分子式为C1884H2975N517O581S16，其中该蛋白中甘氨酸含量最高，为9.0%，色氨酸含量最低，为0.8%，不稳定系数为21.99，属于稳定蛋白，脂肪系数81.72，总平均亲水 性(grand average of hydropathiaty，GRAVY) 为－0.300，为亲水性蛋白； 利用SignalP5.0 预 测CtSAMS1 无信号肽，利用TMHMM 2.0 预测红花CtSAMS1 的跨膜区域，预测结果表明CtSAMS1 没有跨膜区域。

2.2.2 CtSAMS1 蛋白的二级结构分析及三维结构预测 通过ExPASY 中的SOPMA 工具预测CtSAMS1 基因编码蛋白的二级结构，结果显示CtSAMS1 蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(random coil)组成，共有172个，占比为44.1%，其次为α－螺旋(α-helices)，共有130个，占比为33.33%，有延伸链(extended strand)58 个，占比为14.87%，有β－折叠(β-turn)30 个，占比为7.69%。推测无规则卷曲是其最大量的二级结构元件，而α－螺旋、延伸链和β－折叠散布于整个蛋白中(图2-A)。

将红花 CtSAMS1 的氨基酸序列通过SWISSMODEL Workspace 在线分析软件建立了CtSAMS1 的三维结构模型(图2-B)，三级结构预测结果表明，CtSAMS1 与拟南芥的S－腺苷甲硫氨酸合成酶1(PDB code: 6vcx)序列一致性为89.92%。

2.2.3 CtSAMS1 氨基酸序列分析和系统进化树分析 利用NCBI 的蛋白保守区数据库(conserved domain database，CDD) 对 CtSAMS1进行保守区预测，CtSAMS1 具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域，属于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，利用Prosite 数据库进行蛋白功能结构域预测，该蛋白含有3 个SAMS 蛋白的特征序列 GHPDK、 GAGDQGHMFGY 和GGGAFSGKD(图3)。

多重序列分析表明，红花CtSAMS1 氨基酸序列与拟 南 芥(Arabidopsis thaliana)、 苜蓿(Medicagotruncatula)、蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)和玉米(Zea maysL.)中SAMS 氨基酸序列相似性分别为88.04%、94.62%、98.72%和87.59%，说明CtSAMS1的氨基酸序列与其他植物中氨基酸序列之间具有较高的同源性(图3)。为进一步分析CtSAMS1 基因与其他植物SAMS基因的进化关系，通过NCBI 搜索到其他植物的21 条SAMS 蛋白序列，利用MEGA7.0 构建了系统进化树(图4)，结果发现CtSAMS1 与来自菊科的洋蓟(Cynara cardunculusvar. scolymus)、 黄花蒿(Artemisia annua)、 莴苣(Lactuca sativa)、 除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)的SAMS 亲缘关系最近，与其他科中的SAMS 亲缘关系相对较远。

2.3 CtSAMS1 基因组织表达特性分析

为了对CtSAMS1 基因的表达特性性进行研究，通过qRT-PCR 对红花不同组织中的基因表达进行定量分析，提取了红花根、茎、叶、花(盛花期)、苞片的RNA，反转录成cDNA，通过qRT-PCR 检测其表达情况，结果表明，CtSAMS1 基因在花中表达量最高，其次是茎，在根、叶、苞片中表达量极低，说明CtSAMS1 基因表达具有组织特异性(图5)。通过qRT-PCR 对不同发育时期红花花冠中CtSAMS1 基因表达量进行了定量分析，结果表明，CtSAMS1 基因表达量随着红花花瓣的衰老而增加(图5)，说明CtSAMS1 基因可能参与红花花瓣的衰老过程。

2.4 CtSAMS1 基因在不同非生物胁迫和激素诱导下的表达分析

2.4.1CtSAMS1 基因在不同非生物胁迫下的表达分析 通过qRT-PCR 对不同非生物胁迫处理的红花花冠基因表达进行定量分析，结果表明盐、干旱和低温(4℃)处理都能诱导CtSAMS1 基因的表达。经盐胁迫处理后，CtSAMS1 基因表达在12 h 达到高峰，而20%PEG6000 诱导产生的干旱胁迫条件下，CtSAMS1 基因的表达在6 h 即达到高峰，4℃低温处理后，CtSAMS1基因在3 h 表达量最大，随后降低，在24 h 又出现上升趋势(图6)。

2.4.2CtSAMS1 基因在不同激素诱导下的表达分析 为了研究CtSAMS1 基因表达是否受到激素的调控，对离体培养红花花冠进行MeJA、SA、ABA、GA3 处理，通过qRT-PCR 对其表达变化进行定量分析，结果表明，MeJA、SA 和ABA 对CtSAMS1 基因的表达都具有诱导作用。MeJA 处理后，随着时间推移基因表达量逐渐升高；SA 处理后6 h，基因表达量达到最高峰，随后表达量迅速下降；ABA 处理后3 hCtSAMS1 基因表达量达到高峰，随着时间的推移，其表达水平一直维持在较高水平，而GA3 处理对CtSAMS1 基因的表达有一定的抑制作用，但抑制效果不明显(图7)。

3 讨论

SAMS 是S－腺苷甲硫氨酸代谢途径的关键酶，催化反应的产物S－腺苷甲硫氨酸是生物合成乙烯和多胺的前体，而乙烯和多胺参与植物生长发育、生物和非生物胁迫等多个生理过程。近年来，越来越多的研究发现SAMS 也参与多种生物和非生物胁迫[7－8]。

植物中的SAMS 由一个多基因家族编码，同一植物基因组中往往有多个拷贝，它们的表达方式有所不同，从而在植物生长发育的不同阶段或不同生理状态下发挥作用。所以对红花中CtSAMS在不同非生物胁迫和激素处理下的表达分析，有利于研究CtSAMS基因在红花抗逆境胁迫中的作用。本研究利用RACE、qRT-PCR 技术在红花中克隆得到1 条CtSAMS基因全长，对其进行了生物信息学分析，三维结构预测结果表明红花中CtSAMS与拟南芥SAMS 的三维结构相似[21]，多重序列分析发现，CtSAMS与其他物种具有较高的同源性，并且具有3 个SAMS 的特征序列，进化序列分析结果表明CtSAMS与菊科SAMS 蛋白的相似性较高。

研究发现不同植物的SAMS具有不同的表达模式，如拟南芥基因组中有4 个SAMS基因，其中AtSAMS1 和AtSAMS2 在根和茎中表达量最高[22]，豌豆中PsSAMS1 和PsSAMS2 在不同发育时期表达量不同[23－24]；玉米基因组中共有4 个SAMS 基因，它们在不同组织部位和不同胁迫条件下的表达模式有很大差异性[25]；本研究表明，红花中的CtSAMS1 基因表达具有组织特异性，在花中表达量最高，其次是茎，在根、叶、苞片中表达量极低。大量研究表明乙烯信号途径在植物器官衰老和成熟中发挥重要作用，其中，SAMS作为乙烯合成途径的关键酶，通过调节乙烯合成量参与植物的生长发育过程。本研究对表达量较高的红花花瓣不同发育时期CtSAMS1 基因表达量进行了分析，结果表明随着红花花瓣的衰老CtSAMS1 基因的表达量增加，推测CtSAMS1 基因参与红花花瓣衰老生理过程。

植物在生长过程中会受到干旱、盐、低温等多种非生物胁迫，这些非生物胁迫会引起植物代谢途径及信号途径相关基因的表达变化[26－28]。目前，大量研究发现，SAMS基因受多种逆境胁迫因子的诱导，如蝴蝶兰MtSAMS基因受到低温胁迫处理后表达量明显上升[20]，Guo 等[14]研究发现紫花苜蓿叶片的MfSAMS1能被低温、ABA、H2O2和一氧化氮(NO)诱导，并且过量表达MfSAMS1 基因能够显著提高紫花苜蓿的抗冷能力；长春花中的3 个SAMS基因表达也都受到盐胁迫处理的诱导[25]。本研究结果表明盐、干旱和低温等非生物胁迫均能促进CtSAMS1 基因的表达，说明CtSAMS1 基因参与红花的非生物胁迫防御反应。

大量研究发现，SAMS基因的表达还受多种激素的调控[29－31]，如ABA 处理番茄后，番茄SlSAMS1 和SAMS3 基因表达量明显升高[19]；ABA 对盐地碱蓬的SgSAMS2 基因表达也具有显著的诱导作用[32]；MeJA、SA、ABA、GA3 处理白木香(Aquilaria sinensis)愈伤组织后，白木香AsSAMS1 的基因表达明显升高[7]，本研究表明CtSAMS1 基因也受MeJA、SA 和ABA 诱导，GA3 对CtSAMS1 基因表达有一定的抑制作用，说明不同激素CtSAMS1 基因受多种激素交叉调控。对CtSAMS基因非生物胁迫和激素处理下的表达分析，为进一步研究红花S－腺苷甲硫氨酸生物合成及调控分子机制奠定了基础，同时有利于丰富植物的防御反应研究。

4 结论

本研究克隆了红花CtSAMS1 基因的全长cDNA 序列，其ORF 序列长1 173 bp，编码390 个氨基酸，具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域(PLN02243)，属于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，对该基因的表达特性进行分析表明，CtSAMS1 基因表达具有组织特异性，主要在花和茎中表达，在其他组织部位中表达量较低，并且随着花衰老其表达量呈上升趋势；盐、干旱和低温非生物胁迫处理能诱导CtSAMS1 基因表达，MeJA、SA 和ABA 处理也能够诱导CtSAMS1 基因表达，GA3 对CtSAMS1 基因具有一定抑制作用。本研究为后续深入研究CtSAMS1 基因功能奠定了基础。