利用染色体片段置换系群体定位水稻芽期耐低温主效QTL

邓浩东 余镁霞 吴光亮 罗 鑫 宋贵庭 陈利平 贺浩华 边建民

(1作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西 南昌 330045；2作物生理生态与遗传育种江西省重点实验室，江西 南昌 330045；3江西省水稻高水平工程研究中心，江西 南昌 330045)

水稻(Oryza sativaL.)起源于热带和亚热带地区，是目前世界上主要的粮食作物之一。低温胁迫使水稻种植受到限制，大部分水稻分布在中国、美国、日本、韩国等国家和地区[1]。低温胁迫会对水稻整个生长时期造成危害。芽期遭遇冷害，水稻幼芽生长缓慢且成活率降低[2]，后期分蘖数也会降低[3－4]。孕穗阶段遭到冷害，穗数和穗粒数减少，产量降低[5－6]。因此，提高水稻耐冷性是水稻抵御低温胁迫，提高产量的必然要求。

水稻耐冷性属于数量性状，受主效基因和微效多基因共同控制[7]。随着分子标记技术的发展，通过分子标记已在水稻的所有12 条染色体上定位了多个水稻芽期耐低温相关数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)[8]。曾亚文等[9]以农林20 和冲腿为亲本，发现水稻孕穗期耐冷性QTL 主要分布在第1、第3～第8、第10 和第12 号染色体上。詹庆才等[10]以我国南方稻区苗期不耐冷的早熟籼稻品种二九青和日本北海道地区耐冷粳稻品种Yukihikari 自交得到的重组自交系(rcombinant ibred lnes，RILs)群体为材料，以叶绿素含量为指标，共定位11 个苗期耐冷相关的QTL。杨永霞等[11]以籼粳交组合IR64/Azucena 产生的105个双单倍体(duble hploid，DH)为遗传材料，在水稻三叶期定位了17 个苗重耐冷性动态QTL。吴杏春等[12]利用Lemont/Dular 杂交衍生的RILs 群体为材料，定位到5 个苗期耐冷相关的QTL:qGRP－2a、qGRP－2b、qGRP－2c、qGRP－7a和qGRP－7b。邹德堂等[13]以黑龙江高产优质水稻品种东农422 和耐冷性强的空育131杂交衍生的F2∶3群体为遗传材料，定位到21 个分蘖期耐冷相关的QTL。张艳梅等[14]以140 份东北粳稻品种(系)为材料进行耐冷分析，鉴定到18 个与分蘖期耐冷显著相关的QTL。林静等[15]以籼稻品种9311 为受体、粳稻品种日本晴为供体构建的染色体片断置换系(chromosome segment subctitution lines，CSSLs)群体为材料，鉴定到4 个与芽期耐冷相关的QTLs:qCTB－5－1、qCTB－5－2、qCTB－5－3 和qCTB－7。在目前已定位的影响水稻耐冷的QTL 中，只有少数得到了克隆。如，qLTG3－1[16]和OsSAP16[17]控制水稻芽期低温耐受性，bZIP73[18]、LTG1[19]、COLD1[20]、HAN1[21]和qBSR10[22]控制水稻幼苗低温耐受性，Ctb1[23]和CTB4a[24]控制水稻孕穗期低温耐受性。分析其原因可能是定位水稻低温胁迫相关QTL 多采用RIL 等群体，复杂的遗传背景增加了QTL 克隆和育种应用的难度。通过对这些QTL 进行克隆，为研究复杂遗传和分子机制提供了坚实的基础[25]。

CSSLs 群体是以一水稻亲本为供体，另一水稻亲本为受体，并将供体的一个或部分染色体片段导入受体所构建的群体。该群体与受体水稻亲本相比，只在个别染色体区段上有所差别，大部分染色体片段与受体亲本一致，定位的QTL 可以通过构建次级分离群体进行快速克隆[26]。该群体目前已用于水稻非生物胁迫耐受性[27－28]、产量性状[29]、粒形[30]等相关性状QTL的定位。

本研究以新构建的一套9311(受体)/日本晴(供体)CSSLs 群体为材料，在芽期进行不同低温处理，测定低温胁迫后水稻种子存活率并定位相关QTL，以期为克隆和应用水稻芽期耐冷QTL 奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以籼稻9311 作为轮回亲本，粳稻日本晴作为供体亲本，经过一轮杂交、三轮回交和六轮自交，获得了BC3F6遗传群体。从BC3F6群体中选择性状稳定的121 个株系中的单株用于CSSLs 群体构建。

1.2 基因分型和遗传连锁图谱的构建

利用全基因组重测序技术对121 个单株进行基因分型。具体方法:提取亲本及121 个单株的基因组DNA；利用物理法断裂DNA，并构建～300 bp 的文库；通过深圳华大基因的MGISEQ－2000 设备对文库测序。基于测序结果进行多态性标记的筛选并分类，然后将连续多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记且具有相同基因型的概括为一个bin 标记[31]，利用这些bin 标记结合JoinMap 4.2软件构建CSSLs 群体的高密度图谱。

1.3 试验方法

从亲本和CSSLs 群体每个家系所收获的种子中选取40 粒饱满的种子，先经5.5%次氯酸钠消毒后，再用蒸馏水漂洗干净。将该40 粒种子置于9 mm 无菌培养皿中，底部放置一层滤纸，每个培养皿中加入蒸馏水，至刚好浸没种子，并置于28℃条件下浸种催芽。待种子萌发后，选择其中整齐一致的30 粒种子，置于恒温培养箱7℃低温条件下处理7 d，最后在28℃恢复生长3 d，测定种子存活率。15℃低温处理与7℃低温处理过程相同。种子存活率标准:低温处理后幼芽迅速生长的种子记为正常发芽的种子，幼芽死亡和生长不明显的种子记为异常发芽的种子。种子存活率＝正常发芽的种子粒数/30×100%，每个试验重复3 次，并计算平均值。

1.4 统计分析

采用IciMapping V4.2 软件对CSSLs 群体进行数据分析和QTL 定位，利用完备区间作图法(inclusive composite interval Mapping，ICIM)检测QTL，当QTL 的或然率的对数LOD 值超过3.0 时，被认为是可信的QTL。参考McCouch[32]的原则命名QTL，即q＋目标性状＋所在染色体号数或连锁群代号，名称用斜体[33]。用SPSS 22软件与Microsoft Excel 2017 内置公式进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 遗传图谱构建

以100 kb 为一个bin 窗口，滑动所有子代样品的每条染色体，根据每个样品基因型来源，以bin 为单位得到该群体每个子代的maker 信息(与亲本日本晴相同的基因型转化为标记2，与亲本9311 相同的基因型转化为标记0，无法判断的基因型转化为标记－1)。经过筛选，最终获得655 个平均分布在12 条染色体上bin 标记。其中，标记最少的是9 号染色体，仅为33个，标记最多的是11 号染色体，为76 个(表1)。进一步利用这些bin 标记分析121 个家系，经过基因型分析，保留其中背景相对纯合的117 个家系构建了染色体片段置换系图谱。该图谱总距离为1 480.2 Mb，约97%的基因组被日本晴片段置换覆盖(图1)。其中，2个相邻标记之间的平均距离为0.60 Mb，11 号染色体的平均距离最小，为0.38 Mb，8 号染色体上的平均距离最大，为0.84 Mb。

表1 染色体标记信息及遗传距离信息Table 1 The bin marker number and genetic distance between adjacent bins

2.2 亲本和置换系群体低温处理表型分析

两种不同低温处理后，亲本及CSSLs 群体种子存活率表型数据统计分析见表2。7℃低温处理后，亲本日本晴种子存活率明显高于9311；15℃低温处理后，亲本日本晴和9311 种子存活率均在95%以上，表明日本晴和9311 芽期种子存活率在两种低温处理下表现不同。而CSSLs 群体种子存活率在两种温度处理后表现出不同程度的差异(表2)。经偏度及峰度检验表明，CSSLs 群体种子存活率在两种不同温度处理后均表现为连续分布，具有广泛的变异幅度，并存在明显的超亲分离现象(表2、图2)。表明CSSLs 群体芽期在不同温度处理后，种子的存活率表现出典型的数量性状特征，符合QTL 定位要求。

表2 亲本及CSSLs 群体芽期7℃和15℃低温处理后种子存活率表型值Table 2 Phenotypic analysis of seed survival rate after 7℃and 15℃treatments at the bud bursting period for parents and CSSLs population

2.3 不同温度处理相关性分析

对CSSLs 群体芽期7℃和15℃低温处理后种子存活率进行相关性分析，结果表明，7℃和15℃处理后种子存活率相关系数仅为0.07，相关性不显著。表明该CSSLs 群体7℃和15℃低温处理后的芽期种子存活率表现没有直接联系。

2.4 低温处理QTL 定位分析

对两个不同温度处理后种子存活率进行QTL 分析，共定位到3 个芽期耐低温主效QTL(表3、图3)，贡献率(phenotypic variance explaines，PVE)为14.92%～25.69%。在7℃处理后定位到2 个芽期耐低温相关的主效QTL:qCS7T10 和qCS7T11，分别位于水稻的第10和第11 号染色体上，其LOD 值分别为7.26 和5.87，贡献率分别为18.85%和14.92%，其增效等位基因均来自9311。15℃低温处理后定位到1 个与芽期耐低温相关的主效QTL:qCS15T5，位于水稻第5 号染色体上，LOD 值为7.61，贡献率为25.69%，其增效等位基因来自9311。

表3 CSSLs 群体定位的芽期7℃和15℃低温处理后影响种子存活率的QTLTable 3 QTL mapping of seed survival rate after 7℃and 15℃treatments at the bud bursting period using CSSLs population

3 讨论

3.1 籼稻和粳稻芽期耐低温遗传分析

在水稻生长早期，低温胁迫会使籼稻和粳稻生长受到不同程度的抑制[31]。本研究利用9311 和日本晴进行芽期不同低温胁迫处理。结果显示，7℃处理后，日本晴种子存活率明显高于9311，而在15℃处理后，两亲本间种子存活率接近，表明不同低温处理下控制水稻芽期种子存活率的机制可能不同。为了解析其中存在的遗传差异，利用9311/日本晴衍生的CSSLs 群体，在7℃和15℃条件下对水稻芽期耐低温主效QTL进行定位分析。结果显示不同低温处理后，控制芽期种子存活率的QTL 不同，表明7℃和15℃条件下，控制9311 和日本晴芽期耐低温的表达基因(QTL)确实存在差异。此外，定位的3 个水稻芽期耐低温QTL 的增效等位基因均来自9311，表明籼稻9311 中存在控制芽期耐低温的主效QTL，而日本晴中可能存在控制芽期耐低温的微效QTL。这与CSSLs 群体中芽期耐低温表型的超亲分离现象相吻合，类似的结论在Baruah等[34]、Miura 等[35]和Wang 等[36]关于水稻耐冷的研究中也有提及。表明水稻生长早期，籼稻中可能存在耐低温的主效QTLs。

3.2 QTL 比较

通过比对发现，15℃低温处理后定位的芽期耐低温主效QTLqCS15T5(物理位置:Chr5: 4.8～6.3 Mb)与Kusumi 等[37]检测的V1 位点位置接近。Mao 等[21]在11 号染色体定位到苗期耐冷QTLHAN1，但与本试验定位的qCS7T11(物理位置:Chr11: 24.25～24.6 Mb)不在同一位点。目前鲜有与qCS7T10(物理位置:Chr10: 2.3～2.75 Mb)相同或接近的水稻耐冷QTLs相关报道。

林静等[15]以类似的CSSLs 群体在5℃处理10 d，30℃恢复10 d 后测定水稻种子成苗率，共鉴定到4 个芽期耐低温QTL 位点(qCTB－5－1、qCTB－5－2、qCTB－5－3 和qCTB－7)。这4 个QTL 与本试验定位的3 个芽期耐低温主效QTL 位置不同，分析其原因可能是由于低温处理和恢复时间不同造成的。本研究关注的是低温处理7 d 后水稻种子快速(3 d)恢复发芽的能力，而林静等[15]关注的则是低温处理10 d 后种子长时间(10 d)恢复发芽的能力。水稻芽期耐冷性是一个复杂的过程，不同低温处理和不同处理时间调控水稻耐冷的遗传机制可能存在差异。因此，后续对水稻芽期耐冷的深入研究是很有必要的。

3.3 水稻低温胁迫后快速恢复发芽能力的重要性

随着气候变化加剧，低温冷害已经成为影响水稻正常生产的主要自然灾害之一。南方籼稻品种，特别是早籼品种，在播种萌发后经常遭遇低温冷害。因此，如何提高水稻芽期耐冷性成为育种家关心的重要生产问题之一。随着分子标记技术的发展，利用分子标记进行耐冷QTL(基因)的聚合已成为提高水稻耐冷性的一条有效途径。传统研究定位的芽期耐低温QTL多来源于粳稻品种，由于遗传背景的不同，这些芽期耐低温QTL 很难直接在籼稻上转育利用。本研究利用CSSLs 群体定位了3 个芽期耐低温QTL，其增效等位基因均来自籼稻9311。因此，可以利用籼稻9311 作为中间材料，通过分子标记辅助选择技术将这些芽期耐低温的主效QTL 转入其他籼稻品种中，提高籼稻品种的芽期耐低温能力。

4 结论

本研究以9311(受体)/日本晴(供体)染色体片段置换系群体为材料，在7℃和15℃低温处理后，共检测到3 个水稻芽期耐低温QTL。其中，qCS15T5 与已报道的基因可能是同一基因或等位基因，位于第10 号染色体上的qCS7T10 和第11 号染色体上的qCS7T11可能是新的低温胁迫QTL。本研究结果为水稻芽期耐低温QTL 的基因克隆和分子标记辅助选择育种奠定了一定的理论基础。