桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

李 森 王庆杰 陈修德 张 蕊 李 玲 杜桂英 付喜玲

(1山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室/山东果蔬优质高效生产协同创新中心，山东 泰安 271018；2五莲县果树站，山东日照 262300)

生物和非生物胁迫是限制作物产量的主要环境因素。非生物胁迫影响植物的生理和生化层面，从而影响基因和蛋白的变化[1－2]。干旱胁迫作为最严重的非生物胁迫之一，极大地限制了植物的分布和作物产量[3]。近年来，随着设施果树栽培的迅猛发展，桃树已成为保护地栽培的主要树种之一，其栽培面积不断扩大[4]。桃属于蔷薇科核果类果树，在中国大部分地区都有分布。但在部分缺水地区，干旱严重影响桃的生长发育及产量[5]。植物适应干旱胁迫依赖各种分子调控网络，转录因子在其中起着重要的作用。有研究发现，在桃中miRNAs、WRKY 转录因子和自噬相关基因能够响应干旱胁迫[6－7]；在桃WRKY 转录因子家族中WRKY11、WRKY18 及WRKY70 可能在干旱胁迫过程中发挥重要作用[8－9]。

WRKY 转录因子在植物生长发育及非生物胁迫过程中起着重要作用[10]。其N 端含有WRKY 结构域，此结构域由保守的WRKYGQK 氨基酸残基组成，是调控基因表达的关键区域[11]。C 端含有一个新型的C2H2 或C2HC 锌指结构域。根据WRKY 结构域和锌指结构域的特征，WRKY 转录因子一般分为三大类，其中Ⅱ类WRKY 可以分为Ⅱa-e 五个亚类[12－13]。WRKY 基因表达具有组织特异性，受到各种非生物胁迫的诱导。已有研究证实，拟南芥(Arabidopsis thaliana)[14－15]、 烟 草(Nicotiana benthamiona)[16]的WRKY 基因响应干旱胁迫。AtWRKY63 参与脱落酸(abscisic acid，ABA) 信号途径及干旱胁迫响应。AtWRKY57 过量表达能够增强拟南芥对干旱的抗性。AtWRKY18 基因受干旱诱导表达上调，并且可能通过调控AtDREB2A基因来提高抗胁迫的能力。研究还表明，AtWRKY18 在病原体反应中具有重要作用[17]。此外，AtWRKY18 还能够响应非生物胁迫及介导ABA 信号转导[18－19]。在干旱处理下，AtWRKY18 作为ABA 信号的正调控因子起着关键作用[20]。肖培连等[21]通过研究葡萄的各种非生物胁迫，发现干旱胁迫能够诱导VvWRKY18 基因的表达。Chen 等[9]研究桃WRKY 转录因子在花芽休眠时期的表达情况，发现Prupe.1G393000 在自然休眠期起着关键作用。植物在冬季的自然休眠伴随着干旱缺水环境，因此猜测桃Prupe.1G393000 转录因子可能在干旱胁迫中发挥关键作用。

本研究从桃鲁蜜一号克隆出一个WRKY 转录因子(Prupe.1G393000)，命名为PpWRKY18，对其进行了生物信息学分析、亚细胞定位和诱导蛋白分析，利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技术分析其在干旱胁迫及复水下基因表达变化，旨在为进一步明确PpWRKY18 的生物学特性及响应干旱机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以两年生设施栽培条件下桃鲁蜜一号(Prunus persicaL. cv. Lumi 1)为试验材料(来源于山东农业大学园艺试验站)，根据Wang 等[7]叶片自然干旱处理方法，在2、4、6、8、10、11 和12 d 取样，13 d 干旱复水，14 d 取样，并将样品用液氮速冻后置于－80℃冰箱保存，用于后续试验。

1.2 RNA 提取及qRT-PCR

按照RNA prep Pure Plant Kit[DP441，天根生化科技(北京)有限公司]试剂盒所提供的方法提取桃叶片 RNA，测定RNA的浓度及质量。利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]反转录成cDNA。以UBQ作为内参基因，采用SYBR Premix Ex Taq 进行RT-qPCR，PCR 循环结束后，利用溶解曲线测定，采用2－ΔΔCT方法进行相对定量表达分析。

1.3 WRKY18 基因克隆

利用桃基因登录号( Prupe. 1G393000) 在Phytozome v12.1 网站查找编码序列( Coding sequence)。利用DNAMAN 软件设计引物(表1)，以桃cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增体系为10 μL 5×HF PhusionBuffer、1 μL 10 mmol·L－1dNTPs、2.5 μL Forward primer、 2.5 μL Reverse primer、 1 μL TemplateDNA、0.5 μL Phusion DNA Polymerase，加水至50 μL。反应程序为: 98℃预变性30 s； 98℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min (共34 个循环)；72℃终延伸10 min，10℃保存。扩增后的PCR 产物进行琼脂糖电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]对目的片段进行凝胶回收纯化；将目的片段连接pEASY-Blunt Zero 载体，过夜转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，挑选阳性克隆单菌落，送到生工生物工程(青岛)股份有限公司测序，获得目的基因。

1.4 生物信息学分析

通过GSDS(http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)网站绘制PpWRKY18 基因结构图。利用 WoLF PSORT(https:/ /psort.hgc.jp/)网站对PpWRKY18 蛋白进行亚细胞定位预测；利用PlantTFDB(http:/ /planttfdb.cbi. pku. edu. cn/index. php) 及 TAIR (http:/ /www.arabidopsis.org)网站BLAST 查找不同物种的WRKY18蛋白氨基酸序列，通过DNAMAN 软件分析其保守序列，根据Tamura 等[22]的方法利用MEGA6 进行系统进化树分析。采用STRING (https:/ /string-db.org)网站预测互作蛋白，利用Cytoscape 软件进行可视化分析。

1.5 亚细胞定位

使用载体为带绿色荧光蛋白的pZP211 载体，根据PpWRKY18 基因的全长序列和载体图谱设计引物序列(表1)，将去掉终止密码子的PpWRKY18 全长编码序列(coding sequence，CDS)序列片段连接到pZP211载体，得到PpWRKY18-GFP 融合表达载体，然后根据Chen 等[23]的方法，将PpWRKY18-GFP 质粒转入GV3101 型农杆菌感受态细胞，利用PCR 鉴定是否为阳性克隆；挑取阳性农杆菌单菌落分别置于含卡那霉素(50 mg·L－1)和利福平(50 mg·L－1)的发根农杆菌YEP(yeast extract peptone)液体培养基中，放置28℃摇床中活化2 次，当菌液浓度为OD600值为0.8 左右，离心5 min，吸除上清收集菌体，用侵染缓冲液(10 mmol·L－1MES-KOH、10 mmol·L－1MgCl2、0.1 mmol·L－1乙酰丁香酮)重悬菌体至OD600值为0.5～0.6，室温静置4 h 后将重悬菌液注射到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片背面。培养箱培养2 d 后，在激光共聚焦显微镜下观察PpWRKY18-GFP 信号并拍照记录，采用二脒基苯基吲哚(diamidino-phenyl-indole，DAPI)染料进行核定位分析。

1.6 PpWRKY18 原核载体构建及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

根据蛋白表达载体PGEX4T－1 序列设计引物(表1)，将PpWRKY18 全长CDS 序列连接到载体上，然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，成功构建表达载体GST-PpWRKY18。当菌液浓度OD600达到0.6～0.8 后，加入1 mmol·L－1异丙基－β－D－硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，在30℃条件下诱导蛋白，分别在0 h 和6 h 时取样。6 h后离心收集菌体，用5 mL PBS 缓冲液悬浮，超声破碎6 s，停9 s (25 个循环)，分离可溶性蛋白和包涵体，4℃、10 000×g条件下离心10 min，收集上清和沉淀。经聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后将蛋白转移到考马斯亮蓝液体中染色30 min，然后进行脱色观察，拍照。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

2 结果与分析

2.1 PpWRKY18 基因克隆及序列分析

以桃叶片cDNA 为模板，利用GFP-WRKY18-F/R引物进行扩增，得到Prupe.1G393000 基因(图1)。Prupe.1G393000 基因的CDS 序列长度为984 bp，编码327 个氨基酸。在拟南芥基因组网站TAIR 进行BLAST比对，发现Prupe. 1G393000与拟南芥中AtWRKY18 基因最为相似，因此命名为PpWRKY18。对PpWRKY18 基因结构进行分析，发现其含有5 个外显子和4 个内含子(图2)。

2.2 PpWRKY18 进化树分析

在PlantTFDB 网站中下载梅、梨、苹果、葡萄和拟南芥中的WRKY18 氨基酸序列，利用MEGA6 软件，通过邻近算法[24]对不同物种中的WRKY18 蛋白进行系统进化树分析，如图3 所示。桃PpWRKY18 与梅PmWRKY18、梨PbrWRKY18 和苹果MdWRKY18 亲缘关系较近，表明蔷薇科物种WRKY18 蛋白功能具有更高的相似性。进一步通过DNAMAN 软件进行多序列比对，结果表明6 个物种的WRKY18 蛋白都含有保守的WRKYGQK 氨基酸七肽序列(图4)。

2.3 PpWRKY18 蛋白的亚细胞定位

为确定PpWRKY18 蛋白在细胞的定位情况，通过WoLF PSORT 网站预测，PpWRKY18 蛋白可能定位在细胞核中。将GFP-PpWRKY18 融合表达载体通过农杆菌注射到本氏烟草叶片，培养2 d 后，通过共聚焦显微镜发现PpWRKY18－pPZP211 的融合蛋白在烟草中只有在细胞核中才能观察到绿色荧光，进一步使用DAPI 染色发现信号重叠。综上表明PpWRKY18 蛋白定位于细胞核中。

2.4 PpWRKY18 诱导蛋白分析

通过GST-WRKY18 引物扩增基因，并连接到PGEX4T－1 载体上。将PGEX-PpWRKY18 融合质粒转入表达感受态细胞BL21(DE3)中，利用1 mmol·L－1IPTG 在37℃诱导蛋白表达，6 h 后取菌液，并进行超声波破碎，利用SDS-PAGE 检测是否有蛋白的产生，结果如图6 所示。在0 h 无IPTG 诱导时，没有目的蛋白表达，重组质粒经IPTG 诱导6 h 后产生了一条分子量大于55 kDa 的特异性条带，由于载体中GST 表达标签为26 kDa 左右，PpWRKY18 蛋白大小约为65 kDa，所诱导蛋白的实际大小符合预期。综上所述，1.0 mmol·L－1的IPTG 可诱导PpWRKY18 融合蛋白的表达，蛋白主要存在于包涵体中。

2.5 PpWRKY18 响应干旱胁迫信号

由图7 可知，随着干旱胁迫时间的延长，PpWRKY18 的表达量也呈现逐渐上升的状态。干旱胁迫12 d 时，PpWRKY18 的表达量较处理初期显著增加，第13 天干旱复水，次日取样(14 d)，定量结果显示PpWRKY18 的表达量显著降低，这表明PpWRKY18 受干旱胁迫所诱导。

2.6 PpWRKY18 相互作用蛋白预测

为进一步研究PpWRKY与响应干旱信号通路基因的互作关系，利用STRING 网站查找PpWRKY18 的相互作用蛋白，然后通过Cytoscape 软件进行可视化分析，结果如图8 所示。与PpWRKY18 互作的干旱通路蛋白可能有蛋白磷酸酶家族(Protein Phosphatase 2C，Prupe.6G078500，Prupe.6G254600，Prupe.3G000700)、C2H2 蛋白家族(ZAT5，Prupe.6G113100)、ERF 蛋白家族( ERF9，Prupe. 4G051400)、 BHLH蛋白家族(BHLH92，Prupe.1G030500)。

3 讨论

干旱胁迫是影响农业最不利的环境因素之一，它影响作物的产量和质量[25]。对于桃而言，干旱胁迫是限制果实产量和品质的主要因素[26]。植物为了抵御不利环境的影响，在生理和分子上形成了各种不同的调控机制。WRKY 转录因子能够响应生物及非生物胁迫，尤其在非生物胁迫过程中起到重要作用[27－29]。本研究对干旱胁迫的桃叶片进行qRT-PCR，发现干旱胁迫12 d 时，PpWRKY18 基因表达量明显上升且达到最高，干旱复水后PpWRKY18 基因表达量明显下调，这表明PpWRKY18 基因响应桃干旱胁迫。

本研究预测了可能与PpWRKY18 基因互作的干旱信号通路蛋白，大量研究表明，这些蛋白与干旱胁迫密切相关。PpZAT5 基因(Prupe.6G113100)跟拟南芥C2H2 转录因子家族中的AtZAT5 基因相似性最高，ZAT5 基因在抗旱棉花中上调表达，表明ZAT5 基因可能在干旱中有重要的作用[30]。蛋白磷酸酶家族基因(protein phosphatase 2C)也跟干旱密切相关，在玉米中蛋白磷酸酶基因能够响应干旱[31]。有研究报道花生(Arachis hypogaea)AhERF9 基因在干旱胁迫下表达量上调[32]。拟南芥AtBHLH92 基因与侧根形成密切相关，而侧根形成与干旱适应也十分重要[33]。因此，初步推测PpWRKY18 蛋白可能通过互作蛋白来调控桃对干旱胁迫的适应，但具体的调控机制还有待进一步研究。

本研究从桃中克隆Prupe.1G393000 基因，通过基因比对将其命名为PpWRKY18。PpWRKY18 基因CDS序列为984 bp，编码327 个氨基酸。PpWRKY18 基因含有5 个外显子和4 个内含子，其氨基酸序列含有保守的WRKY 功能结构域。系统进化树分析发现，桃PpWRKY18 蛋白与梅PmWRKY18 蛋白最为相似。通过侵染烟草亚细胞定位试验证实PpWRKY18 基因定位于细胞核中。本试验分析了PpWRKY18 的互作蛋白与干旱胁迫密切相关，为深入探索PpWRKY18 基因调控干旱分子机制奠定了基础。

4 结论

本研究通过在干旱胁迫下对PpWRKY18 基因转录水平的变化和生物信息学分析，证实PpWRKY18 响应干旱胁迫信号。在干旱胁迫12 d 时，PpWRKY18 的表达量明显增加，复水后，PpWRKY18 的表达量明显降低。通过农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位证实PpWRKY18 定位于细胞核。利用SDS-PAGE 检测发现PpWRKY18 融合蛋白在沉淀中表达。预测与PpWRKY18 相互作用的蛋白包括蛋白磷酸酶蛋白家族( Protein Phosphatase 2C)、 C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF 蛋白家族(PpERF9)、BHLH 蛋白家族(PpBHLH92)。