褪黑素通过激活Nrf2信号和抑制炎症反应减轻小鼠心脏缺血再灌注损伤

孔令恒，徐臣年，孙 娜，梁 飞，魏 明，苏兴利

西安医学院1基础部基础医学研究所，3药学院，陕西 西安 710021；2北部战区总医院心血管外科，辽宁 沈阳110016

过去30年在动物和细胞实验中，心血管损伤及保护机制的研究取得了令人瞩目的成绩，但在临床转化方面却并不理想，尤其是心肌缺血再灌注（IR）损伤，由于其本身能通过多种复杂的机制引起心肌细胞死亡，这使得防治IR损伤变得更加困难。以往的研究认为，形成IR损伤的机制包括ROS累积、钙超载、线粒体通透性转换孔开放、氧化应激和炎症反应等［1-3］。而探讨调控这些病理过程的关键分子，可以为临床筛选潜在的心脏保护药物提供依据。

褪黑素（Mel）是由松果体分泌的一种神经内分泌激素，能通过激活抗氧化酶和清除自由基发挥抗氧化作用，在心肌梗死、心肌IR损伤、心肌肥厚和心力衰竭等多种心血管疾病中发挥保护作用［4-6］。研究表明，Mel可通过抑制细胞凋亡和线粒体氧化应激减轻IR损伤［7］。核因子E2相关因子2（Nrf2）是维持细胞内氧化还原动态平衡的关键分子，通过调控下游抗氧化酶的转录过程发挥作用［8］。Nrf2广泛表达于心脏、血管、脑、肾脏、肝脏和肌肉等组织［9］。另外，Nrf2激活后可通过抗氧化和调控自噬在心血管疾病中发挥保护作用［10］。然而Mel能否通过激活Nrf2信号改善炎症反应减轻心肌缺血再灌注损伤还不清楚，本研究采用小鼠在体冠状动脉左前降支结扎缺血30 min再灌注2 h或24 h，探讨Mel在心肌缺血再灌注损伤中对Nrf2信号和炎症反应的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

36只8周龄雄性C57/bl6小鼠，购于西安交通大学实验动物中心，体质量为20～25 g；Mel、伊文氏蓝和2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Sigma，ML-385（Selleck）；TNF-α、IL-1β 和IL-6 抗 体（Cell Signaling Technology）；Bax、Bcl2、Nrf2、NQO-1、HO-1和GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），LDH试剂盒（南京建成生物科技有限公司），TUNEL染色试剂盒（Roche），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。所有动物实验操作均通过西安医学院伦理委员会（XYLS2020139）审批。

1.2 心肌缺血再灌注模型和实验分组

采用常规IR造模方法［7］，简述如下：麻醉小鼠后经气管插管连接呼吸机。用6-0缝合线结扎冠状动脉左前降支30 min，再灌注2 h或24 h。假手术组只穿线不结扎。采用随机数字表法将小鼠分为假手术组（Sham）、缺血再灌注组（IR）、Mel处理IR组（Mel+IR）和Mel与Nrf2抑制剂ML-385处理IR组（Mel+ML-385+IR）。再灌注前15 min腹腔注射ML-385（30 mg/kg）［11］，再灌注前10 min腹腔注射Mel（20 mg/kg）［12］。

1.3 心肌梗死面积检测

根据以往报道［7］，再灌注24 h后，用预留线将冠状动脉左前降支结扎，将2%伊文氏蓝注入心脏，沿心脏正中横切一2 mm 薄片，用1%TTC 溶液避光37 ℃水浴15 min，4%多聚甲醛浸泡。数码相机拍照。正常心肌为蓝色，缺血心肌为红色，梗死心肌为白色。梗死面积=梗死区面积/缺血区面积×100%。

1.4 小鼠心脏功能检测

小鼠麻醉后，脱去胸前区被毛，四肢固定在电极上，采用Vevo 2100系统中M超在心脏短轴乳头肌水平测量心脏功能。用Vevo软件测算各组心脏射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）。

1.5 血清中LDH含量检测

收集各组血清，严格按照LDH检测试剂盒说明书步骤操作，酶标仪测定各组吸光值A450nm，并根据说明书公式计算各组LDH含量。

1.6 TUNEL染色

根据文献报道［7］，行常规心肌TUNEL染色，激光共聚焦显微镜下采集图像。TUNEL阳性细胞核呈绿色，DAPI将细胞核染成蓝色，细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞核数/总细胞核数×100%。

1.7 Western blot法检测蛋白表达

提取心肌组织蛋白定量，煮沸10 min；配制SDSPAGE凝胶，常规电泳和湿转法转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，将目的条带放入相应一抗管中：抗Nrf2、抗NQO-1、抗HO-1、抗Bax、抗Bcl2、抗TNF-α、抗IL-1β、抗IL-6和抗GAPDH抗体，4 ℃过夜；第2天，TBST洗膜，用HRP标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗室温孵育2 h，ECL化学显影，用Image Lab图像软件进行灰度值分析，GAPDH为内参蛋白。

1.8 统计学分析

数据采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较各组之间的差异，两组间差异比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Mel改善心肌梗死面积和LDH含量的作用被ML-385阻断

伊文氏蓝/TTC染色和ELISA结果显示（图1），和Sham组比较，IR组心肌梗死面积和血清LDH含量明显增加（P＜0.01）；和IR组比较，Mel+IR组心肌梗死面积和血清LDH含量减小（P＜0.01）；然而，和Mel+IR组比较，Mel+ML-385+IR组心肌梗死面积和血清LDH含量明显增加（P＜0.01）。

图1 各组心肌梗死面积和血清中LDH含量的比较Fig.1 Myocardial infarct size and serum LDH level in each group.A:Evans blue and TTC staining of the heart slices.B:Myocardial infarct size in each group.C:Serum LDH level in each group.INF:infarct size;AAR:Area at risk.**P＜0.01 vs Sham group,##P＜0.01 vs IR group;&&P＜0.01 vs Mel+IR group.

2.2 Mel改善IR心脏功能的作用被ML-385阻断

小鼠心脏超声结果可以看出，和Sham组比较，IR组EF值和FS值显著降低（P＜0.01）；与IR组比较，Mel+IR组EF值和FS值显著提高（P＜0.01）；而与Mel+IR组比较，Mel+ML-385+IR组EF值和FS值明显降低（P＜0.01，图2）。

2.3 Mel减轻IR细胞凋亡的作用被ML-385阻断

Western blot和TUNEL染色结果显示，和Sham组比较，IR组Bax表达和细胞凋亡率增加，Bcl2表达降低，Bax/Bcl2比值增加（P＜0.01）；与IR组比较，Mel+IR组Bax表达和细胞凋亡率降低，Bcl2表达增加，Bax/Bcl2比值减小（P＜0.01）；而与Mel+IR 组比较，Mel+ML-385+IR组Bax表达和细胞凋亡率增加，Bcl2表达降低，Bax/Bcl2比值增加（P＜0.01，图3）。

图3 各组心肌凋亡的比较Fig.3 Myocardial apoptosis in each group (Original magnification:×200).A:Immunoblots of Bcl2,Bax and GAPDH.B:Bax/Bcl2 ratio in each group.C:TUNEL staining.D:Myocardial apoptotic index.**P＜0.01 vs Sham group,##P＜0.01 vs IR group;&&P＜0.01 vs Mel+IR group.

2.4 Mel抑制IR中炎症反应的作用被ML-385阻断

Western blot 结果显示，和Sham 组比较，IR 组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达显著增加（P＜0.01）；与IR组比较，Mel+IR组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达明显降低（P＜0.01）；而与Mel+IR 组比较，Mel+ML-385+IR 组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达显著增加（P＜0.01，图4）。

2.5 Mel激活IR中Nrf2的作用被ML-385阻断

Western blot 结果显示，和Sham 组比较，IR 组Nrf2、NQO-1和HO-1的表达显著降低（P＜0.01）；与IR组比较，Mel+IR组Nrf2、NQO-1和HO-1的表达明显增加（P＜0.01）；而与Mel+IR组比较，Mel+ML-385+IR组Nrf2、NQO-1和HO-1的表达显著降低（P＜0.01，图5）。

图5 各组心肌Nrf2及其底物NQO-1和HO-1表达的比较Fig.5 Expression of Nrf2 and its substrates NQO-1 and HO-1 in each group.A:Immunoblots of Nrf2,NQO-1,HO-1 and GAPDH.B-D:Comparison of Nrf2,NQO-1,and HO-1 among the groups,respectively.**P＜0.01 vs Sham group,##P＜0.01 vs IR group;&&P＜0.01 vs Mel+IR group.

3 讨论

心外膜冠状动脉堵塞或斑块破裂会引起严重、持续的心肌缺血，这会导致不可逆的心肌损伤—心肌梗死，而及时恢复缺血心肌再灌注是挽救缺血心肌的唯一有效途径［13］。然而，再灌注是一把“双刃剑”，除了挽救缺血心肌外，还会引起额外的损伤，即再灌注损伤［14］。关于缺血再灌注损伤的机制以往已有大量报道，但临床转化效果不佳，缺乏潜在的药物治疗方法，这大大限制了缺血性心脏病的预后效果。Mel作为一种内源性神经内分泌激素，能有效清除自由基，降低氧化应激，并且具有低毒、在水和有机溶剂中易溶解的特点，在心血管系统中发挥保护作用［15］。Mel在心肌缺血再灌注损伤中的作用已有较多报道，其机制与抑制细胞凋亡、氧化应激、线粒体自噬、内质网应激等有关［16-19］。而我们前期的研究也证实Mel通过抑制挛缩减轻离体心脏缺血再灌注损伤［20］。本实验结果进一步证实，Mel可减小心肌梗死面积，降低血清中LDH含量；另外，实验结果还发现Nrf2抑制剂ML-385能阻断Mel改善心肌损伤的作用；同时，ML-385能抑制Mel增加EF值和FS值的作用，阻断Mel对心脏功能的改善作用。此外，ML-385还能阻断Mel改善IR细胞凋亡的作用。这些结果进一步证实了Mel能减轻心肌IR损伤，改善心脏功能，而ML-385能阻断Mel的这些作用。

炎症反应在心肌IR损伤过程中发挥重要作用，而炎症因子是促进梗死区愈合和瘢痕组织形成的重要因素［21］。研究表明，心肌再灌注开始时，受损内皮细胞和心肌细胞释放趋化因子如细胞因子、补体或ROS，促使中性粒细胞聚集在梗死区。在细胞粘附分子的作用下，中性粒细胞向心肌细胞迁移，导致血管堵塞，并释放蛋白水解酶和ROS，引起心肌损伤［22］。另外，最新研究发现，下丘脑室旁核注射Mel能通过降低室旁核内氧化应激和炎性因子改善心肌缺血再灌注损伤［23］。本研究结果也表明，Mel能抑制IR心肌组织中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，而ML-385能阻断Mel对IR心肌组织中炎性因子的抑制作用。这一结果提示Mel抑制IR损伤中炎症反应的作用与调控Nrf2信号有关。

Nrf2是细胞内调控氧化还原过程的关键分子，通过激活抗氧化酶的转录而维持氧化还原过程动态平衡［24］。而Nrf2信号在减轻IR后心肌梗死面积，改善心脏功能中发挥了重要作用［25,26］。众所周知，氧化应激是导致IR损伤的重要原因之一［27,28］，而Mel可通过抑制氧化应激减轻IR损伤发挥心肌保护作用［17］，然而Mel能否调控Nrf2信号在心肌IR损伤中发挥抗炎性反应的作用还未见报道。本实验结果显示，Mel可以增加IR中Nrf2及其底物NQO-1 和HO-1 的表达，而ML-385 能阻断Mel对心肌IR中Nrf2及其底物NQO-1和HO-1表达的调控作用。同时，结果显示ML-385还能阻断Mel减小IR心肌梗死面积、血清LDH含量和细胞凋亡的作用，并能阻断Mel改善心脏功能的作用。这些结果表明，Mel能通过激活Nrf2信号改善心肌IR损伤。

综上所述，本研究进一步证实了Mel在小鼠心肌IR模型中具有保护作用，并证实Mel可能是通过激活Nrf2信号减轻炎症反应改善心肌IR损伤。本实验为Mel在缺血性心脏病中的临床应用提供了新的实验支持。