Bax抑制因子1可抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞的钙化

陈韦任，杨 霞，周玉杰，马 茜，吴雪萍，沙 媛，钱 赓

1首都医科大学附属北京安贞医院心内12病房，北京市心肺血管疾病研究所，冠心病精准治疗北京市重点实验室，北京 100029；中国人民解放军总医院2第二医学中心心血管内科，3第一医学中心心血管内科，北京100853

血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病、终末期肾病等多种疾病的病理生理基础，它可以导致动脉粥样硬化斑块破裂、血栓形成等严重后果，是心血管疾病的重要危险因素［1-3］。血管钙化主要表现为血管硬度增加和顺应性下降，其机制和骨发育相似，是主动的、可以调节的过程［4-6］。研究发现血管钙化机制包括细胞凋亡、血管平滑肌细胞（VSMC）由收缩型向成骨样细胞表型分化、钙磷沉积、氧化应激等［7-11］。Bax抑制因子-1（BI-1）是抑制程序性坏死信号通路的关键性调节因子［12-14］。最新研究证实BI-1和心血管疾病密切相关［15-17］。心肌缺血再灌注损伤中，BI-1表达降低，细胞凋亡增加，而激活BI-1能下调线粒体分裂蛋白表达，保护线粒体结构和功能，抑制氧化应激和细胞凋亡，减轻再灌注损伤［18］。BI-1对血管钙化的具体作用目前尚不清楚。本研究通过建立VSMC钙化模型，观察钙化时BI-1的表达和BI-1对钙磷沉积、VSMC骨型分化和细胞凋亡的作用，为临床研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠30只（中国人民解放军总医院动物试验中心提供），4周龄，体质量80～100 g；主要试剂：β磷酸甘油；氯化钙；磷酸盐缓冲液（PBS）；胎牛血清（Hyclone）；DMEM（Gibco）；茜素红S染色试剂盒、碱性磷酸酶试剂盒（Sigma）；钙测定试剂盒（北京中生北控生物公司）；BI-1、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）和β-肌动蛋白（β-actin）（Abcam）。动物实验规程已获批准，符合首都医科大学实验伦理委员会的伦理标准。

1.2 细胞培养、模型建立和实验分组

在洁净台内分离4周SD大鼠胸主动脉，剥去外膜，使用眼科剪将血管剪成小碎块（1 mm2）接种于细胞培养瓶中，置于10%胎牛血清和DMEM培养液中，在37 ℃、5%CO2孵箱中培养［19-21］。3～5 d换液传代1次。经免疫组织化学法和形态学检测VSMC纯度＞95%。

VSMC钙化模型的制作：将细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后加入10 mmol/L β磷酸甘油和7.2 mmol/L氯化钙诱导14 d，每隔2 d换1次液体［22,23］。

实验采用随机方法分为4组：对照组（10%胎牛血清的DMEM液培养14 d）、BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后，10%胎牛血清的DMEM液培养14 d）、钙化组（钙化培养基培养14 d）、钙化+BI-1过表达组（过表达BI-1蛋白后，钙化培养基培养14 d）。每组检测均重复6次实验。

1.3 BI-1过表达质粒的构建

建立BI-1过表达的重组质粒（江苏吉玛基因技术有限公司），将VSMC 接种至6 孔板，以脂质体Lipofectamine 2000转染BI-1，24 h后裂解细胞提取蛋白，使用Western blot法验证转染效果。

1.4 茜素红S染色

钙化诱导14 d后，使用4 ℃PBS缓冲液冲洗3次，多聚甲醛固定15～20 min，PBS冲洗3次。标本中加入l%茜素红S（1 g茜素红S，100 mL蒸馏水），室温下孵育20 min，PBS冲洗细胞3次，显微镜下观察红色钙化结节并拍照。

1.5 Western blot法检测蛋白的表达水平

建模成功后收集细胞，加入细胞裂解液，然后提取细胞总蛋白，使用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度，计算各组上样量。常规进行8%聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）蛋白电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜。5%牛奶封闭1 h后，加入一抗室温孵育30 min、4 ℃孵育过夜，洗膜后使用封闭液稀释的二抗室温孵育40 min。使用化学发光试剂与膜孵育后，暗室曝光，使用Image J软件对条带进行数据分析。

1.6 钙含量的测定

建模成功后，4 ℃PBS冲洗细胞3次，使用0.6 mol/L盐酸37 ℃孵育24 h进行脱钙处理，次日取上清液用于钙含量测定。收集细胞，加入细胞裂解液，提取上清液，BCA定量试剂盒进行蛋白测定。钙含量标准化数值=样品钙含量／样品蛋白含量。

1.7 碱性磷酸酶活性测定

钙化培养基诱导14 d后，4 ℃PBS冲洗3次，加入细胞裂解液裂解细胞，取上清进行测定。按试剂盒说明书加入缓冲液，37 ℃孵育30 min，终止液终止反应，测定405 nm范围内吸光光度值。BCA方法测定细胞总蛋白含量，然后用蛋白含量校正碱性磷酸酶含量。

1.8 VSMC凋亡检测（TUNEL法）

细胞爬片中加入4%多聚甲醛室温下固定30 min，1%Triton X-100液体通透打孔，爬片加入末端脱氧核糖核酸转移酶反应液混匀，冲洗3次后，加入标记液37 ℃反应30 min，荧光显微镜下观察照相。凋亡率=阳性细胞/总细胞数×100%。

1.9 统计方法

采用SPSS19.0软件对数据进行处理。计量资料用均数±标准差表示，组间作t检验分析，多组间采用单因素方差分析，计数资料以百分数表示，比较采用χ2检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMC钙化中BI-1蛋白表达结果

Western blot结果可见随着钙化时间的延长，BI-1蛋白水平逐渐下降。钙化培养基诱导第3d，BI-1蛋白表达开始下降；诱导第7 d，BI-1蛋白下降明显，具有统计学意义（P=0.007），诱导第14 d 下降达到最低值（P=0.001），结果提示BI-1蛋白和钙化时间存在负反馈关系（图1）。

图1 钙化诱导后血管平滑肌细胞BI-1蛋白表达Fig.1 Expression of BI-1 protein in vascular smooth muscle cells with induced calcification.*P＜0.01 vs 0 d,#P＜0.01 vs 7 days.

2.2 过表达BI-1蛋白对细胞钙磷沉积的影响

钙化培养基诱导14 d后，钙化组茜素红S染色可见弥漫性红色钙化结节，而BI-1蛋白过表达后钙化被抑制，钙化结节消退（图2）。另外我们还测定了细胞钙含量和碱性磷酸酶活性。细胞钙含量结果提示，VSMC钙化后，钙含量明显增加，而过表达BI-1可以显著减少细胞钙含量（P=0.0002，图3）。碱性磷酸酶结果提示，VSMC钙化后，碱性磷酸酶活性明显增加，而BI-1过表达能明显降低碱性磷酸酶活性（P=0.0006，图4）。

图2 各组血管平滑肌细胞茜素红S染色结果Fig.2 Alizarin red S staining of the cells in the 4 groups.

图3 各组血管平滑肌细胞钙含量Fig.3 Comparison of calcium content in the cells in the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

图4 各组血管平滑肌细胞碱性磷酸酶活性Fig.4 Comparison of alkaline phosphatase activity among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

2.3 过表达BI-1蛋白对细胞骨型分化的影响

Runx-2和BMP-2是VSMC骨型分化重要标志性蛋白。Western blot结果显示，VSMC钙化后，Runx-2和BMP-2蛋白表达明显增加，BI-1过表达能抑制Runx-2（P=0.0003，图5）和BMP-2蛋白表达（P=0.0001，图6）。

图5 各组血管平滑肌细胞Runx-2蛋白表达Fig.5 Comparison of Runx-2 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

图6 各组血管平滑肌细胞BMP-2蛋白表达Fig.6 Comparison of BMP-2 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

2.4 过表达BI-1蛋白对细胞凋亡的影响

VSMC钙化后，细胞凋亡率明显升高，过表达BI-1能明显降低VSMC凋亡率（P=0.01，图7）。Western blot结果显示，VSMC钙化后，凋亡蛋白活化的caspase-3表达明显增加，而钙化＋BI-1过表达组活化的caspase-3蛋白水平较钙化组明显减少（P=0.0003，图8）。

图7 各组血管平滑肌细胞凋亡率Fig.7 Comparison of apoptosis rate among the 4 groups.

图8 各组血管平滑肌细胞活化的caspase-3蛋白表达Fig.8 Comparison of cleaved caspase-3 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

3 讨论

本研究结果发现，随着钙化时间的延长，BI-1蛋白水平逐渐下降，两者存在负反馈关系；另外BI-1表达下降，伴随着VSMC钙沉积、细胞凋亡和细胞骨型分化增加；而促进BI-1蛋白表达后，VSMC钙沉积、细胞凋亡和细胞骨型分化减少，血管钙化明显减轻。

Lisak等研究发现BI-1不仅可以减少细胞内质网钙浓度，还能降低细胞钙水平，保持细胞内钙稳态平衡［24］。大鼠免疫细胞敲除BI-1蛋白后，细胞内和内质网钙浓度明显增加，细胞坏死增多，免疫功能下降，而过表达BI-1后，细胞钙浓度恢复，免疫功能得以改善，可见BI-1调节钙平衡对免疫系统起到非常重要的作用［25］。Doycheva等认为BI-1能减少缺血缺氧引起的神经细胞凋亡。过表达BI-1能减少小鼠大脑梗死面积，抑制神经细胞凋亡，改善神经系统功能；沉默BI-1后，神经细胞凋亡增多，大脑梗死面积增加，神经系统功能恶化［26］。小鼠急性肾损伤模型中，BI-1表达下降，肾小管细胞凋亡增加，而促进BI-1表达后，肾小管细胞凋亡减少，炎症和氧化应激损伤减轻，肾功能明显改善［27］。近期研究发现BI-1对心血管疾病能起到保护性作用。心肌缺血再灌注损伤时，BI-1蛋白表达减少，而过表达BI-1能降低黄嘌呤氧化酶活性，减少线粒体活性氧爆发，抑制氧化应激，减少细胞凋亡，而抑制BI-1则加重氧化应激和细胞凋亡［28］。另一心肌梗死研究中，BI-1蛋白能抑制心肌细胞坏死，减少心肌梗死面积和改善心脏功能，而基因敲除BI-1后氧化应激增加，细胞凋亡加重，心肌梗死面积增加，心脏功能恶化［29］。本研究中，血管钙化时，BI-1表达下降，VSMC钙含量、细胞凋亡率和caspase-3分泌增多；而过表达BI-1 蛋白后，钙含量、细胞凋亡率和caspase-3分泌减少，血管钙化明显减轻。

血管钙化时，细胞凋亡能促进VSMC骨型分化，而抑制细胞凋亡则减少VSMC骨型分化，BMP-2蛋白表达明显下降［30］。另有研究发现肾脏透析患者VSMC凋亡诱发血管钙化，凋亡的VSMC通过囊泡释放羟基磷灰石促进Runx-2和BMP-2表达，进而诱发血管钙化［31］。本研究中，VSMC钙化后细胞凋亡增加，BMP-2、Runx-2表达增多，而促进BI-1蛋白表达后，BMP-2、Runx-2表达减少，血管钙化明显减轻，因此BI-1可能通过减少细胞凋亡抑制BMP-2、Runx-2表达，进而减轻血管钙化。综上所述，血管钙化抑制BI-1蛋白表达，加重细胞凋亡、钙磷沉积和VSMC骨型分化，而促进BI-1蛋白表达能抑制细胞凋亡、钙磷沉积和VSMC骨型分化，进而减轻血管钙化。由此可见，BI-1蛋白作为新的血管钙化调节蛋白，具有多重细胞保护作用，相信随着BI-1和血管钙化深入研究，将来一定为血管钙化诊断和治疗开辟新的途径。

该研究局限性在于缺乏更深机制研究和动物相关实验，比如BI-1是线粒体重要的调控蛋白，而线粒体融合蛋白（OPA1）/线粒体融合/自噬和血管钙化密切相关［21］，BI-1是否通过该途径抑制线粒体损伤，进而减轻血管钙化。动物实验方面采用血管特异性BI-1过表达小鼠，建立血管斑块钙化模型，测定细胞钙含量、Runx-2、caspase-3等指标，明确BI-1的血管保护作用。另外BI-1能降低细胞钙水平，是否这一改变对细胞内外电位存在影响，进而对钙化产生作用，有待下一步深入研究。