改良脑灌注固定方法在组织透明技术中的效果评估

童海洋，张金，朱清俊，徐金勇,2*，张晓明,2*

(1. 中国科学院合肥物质科学研究院，安徽 合肥 230031；2. 安徽医科大学，安徽 合肥 230032)

组织透明技术可以显著降低组织内部光的散射和吸收，使组织样本处于近乎透明的状态[1]。然而，目前该技术还处于方法的开发和优化阶段[2]。现有的主动透明技术如丙烯酰胺交联替换脂质透明硬化成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶(Clear Lipid-Exchanged Acrylamide-Hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ Hybridization-Compatible Tissue-Hydrogel，CLARITY)等虽然透明效果好，但免疫荧光标记速度慢，设备投入高，一般实验室难以实现，且操作较为繁琐，其广泛运用存在局限性[3]。有机溶剂型透明方法的透明效果较好，操作简单，然而大部分有机溶剂具有毒性，不利于实验人员的健康，且有机溶剂常导致荧光淬灭，组织形态结构也会发生较大变化导致图像失真，实际应用较少。亲水性的透明技术比有机溶剂型的荧光保存度高，操作便捷，对需要多种标记以及带转基因荧光的试验样本非常适合，但缺点是透明速度较慢[4]。因此，开发和优化新型透明技术已迫在眉睫。

灌注固定是脑组织透明步骤中非常重要的一个环节，脑组织能否充分灌注固定，内部的血液能否较充分的冲洗干净对后期透明至关重要。目前，经典的灌注技术还是经心脏灌注，该方法耗时较长且需要大量的灌注液，尤其针对体型较大的动物，心脏灌注法的局限性更大，灌注效果也不理想。本文介绍了经双侧颈总动脉灌注的方法，并分析其在组织透明成像技术中的优越性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠12只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；清洁级新西兰兔6只，购买于武汉市万千佳兴生物科技有限公司。动物饲养于高场磁共振成像安徽省重点实验室(实验动物使用许可证号SYXK皖2018-005)，动物每日12 h黑暗12 h光照，环境温度维持在20～24 ℃，相对湿度维持在40%～65%，并给予充足的饮水和饲料。动物实验获得中国科学院合肥物质科学研究院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

水合氯醛、OCT包埋剂、PBS、Trtion X-100、多聚甲醛、DAPI和抗荧光衰减封片剂均购自国药集团化学试剂有限公司；Anti-CD31 Rabbit pAb及其二抗(山羊抗兔HRP TSA-FITC)购自武汉塞维尔生物公司。

1.3 三通装置制作

取三通阀2个(扬州洋生医药科技有限公司生产)，1个用于2个18G的Y静脉留置针连接三通阀的两端(灌注新西兰兔用)，另1个用于2个22G的Y型静脉留置针连接三通阀的两端(灌注大鼠用)。三通阀另一端用充满生理盐水的150 mL注射器连接，并测试是否漏水，保证连接紧密且无气泡，然后关闭三通阀待用。

1.4 灌注固定程序

SD大鼠和新西兰兔各分为2组，试验组和对照组各半。试验组通过双侧颈动脉灌注，对照组采用常规的心脏灌注。灌注前SD大鼠和新西兰兔均用7%的水合氯醛腹腔注射深度麻醉。

经心灌注技术固定：动物麻醉后在胸部和腹部交界处做一个5 cm左右皮肤切口，用剪刀在膈膜上做一个小切口，沿胸腔慢慢剪开膈肌，暴露胸腔，将胸部肌肉和胸骨反方向翻开，显露心包，揭开心包膜。将装满生理盐水的20 mL注射器的针头经心尖缓慢插入主动脉(眼观主动脉处可见针头)，用持针钳夹住插入针头的主动脉以防脱落，以及防止灌注液渗漏。当生理盐水注入主动脉时，用眼科剪在动物的右心耳上开尽可能大的切口，减轻心内压力。当右心房流出的液体清亮时(此时肝脏内血液被冲洗干净，颜色变淡)，换4%多聚甲醛进行固定，当观察到动物抽搐后僵直的状态即证明灌注成功。

经双侧颈动脉灌注法固定：动物仰卧位正中切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织，暴露气管，分离气管两侧肌肉暴露两侧颈动脉，并分离动脉伴行的神经，然后将备好的三通装置的静脉留置针往远心端方向插入一侧的颈动脉，确认在血管内时拔出留置针头，并用外科缝线打结固定，另一侧行相同的操作。确认固定好留置针后，在保证不损伤颈动脉的前提下尽可能大的剪开两侧颈静脉。当颈静脉流出的液体清亮时，换4%多聚甲醛进行固定，在观察到动物头部抽动时即证明灌注成功。

1.5 开颅取脑

剪去头部，在背侧颈部与鼻之间做一纵向切口，露出头骨。修剪剩下的颈部肌肉，用剪刀尖端插入枕骨大孔内，小心地用剪刀(注意向上提剪防止损伤脑组织)沿枕骨大孔内表面直至颅骨表面的远端剪开，用咬骨钳清除小脑周围以及大脑背侧的骨组织，直至分离出整个脑组织；用手术刀切断大脑腹侧的嗅球和神经连接；用眼科剪除去连接的硬脑膜，取出脑组织置于4%多聚甲醛溶液中过夜，多聚甲醛溶液的体积至少是脑组织体积的10倍。

1.6 组织透明

将脑组织置入适配的脑模具中，从视交叉开始用刀片向后制作3 mm厚度的脑冠状切片。然后将样品放入含有组织透明溶液的离心管中(具体配方专利保护中)，所有含有样品的离心管均浸入恒温水浴锅(37 ℃)中放置3 d。

1.7 光学成像及透光率检测

3 d后，脑切片基本透明，小心地取出脑片，用体视显微镜拍取清晰的组织照片。然后用紫外分光光度计测定透明溶液及透明组织的透光率：用空的比色皿检测空气的透光率，然后以空气为空白参照，检测透明溶液的透光率，再将待测样本放入含有透明溶液的比色皿中，让光穿过组织，以透明溶液透光率为标准检测透明组织的透光率。

1.8 免疫荧光和HE染色

取部分脑组织做石蜡切片进行HE 染色，对照组和试验组分别选取相同位置的切片进行红细胞计数，并进行对比分析。其余脑组织样本放入30%蔗糖PBS溶液中，4 ℃冰箱过夜至沉底。取出脑组织，用OCT包埋剂包埋，然后用冰冻切片机以20 μm 的厚度进行切片。采用常规的冰冻切片免疫荧光法处理样本，标记血管内皮细胞，并用DAPI染核。

1.9 统计方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析，试验重复3次，数据以“平均数±标准差”表示，采用t检验进行分析处理。P<0.05表明差异显著，P<0.01则表明差异极显著。

2 结果与分析

2.1 灌注固定的比较

脑组织分别经2种不同灌注方法灌注固定后，在外观上并无明显差异，均呈乳白色，质地变硬。SD大鼠的灌注固定结果显示，经双侧颈总动脉灌注需要生理盐水50～60 mL，4%多聚甲醛40～50 mL，而传统经心灌注需要生理盐水200～250 mL，4%多聚甲醛180～200 mL；新西兰兔的灌注固定结果显示，经颈总动脉灌注需要生理盐水180～220 mL，4%多聚甲醛150～180 mL，而传统经心灌注需要生理盐水1.2～1.5 L，4%多聚甲醛800～1 000 mL。

对试验得到的灌注液和固定液数据进行统计学分析显示：SD大鼠和新西兰兔经颈总动脉灌注固定需要的生理盐水均较传统经心灌注方法明显减少，差异极显著(P<0.01)，所需固定液(4%多聚甲醛)的量也较传统经心灌注明显减少，差异极显著(P<0.01)，如图1和图2。

注：2种灌注方法比较，**表示所需生理盐水差异极显著(P<0.01)，##表示所需4%多聚甲醛差异极显著(P<0.01)。下同

图2 新西兰兔不同灌注固定方法灌注液使用量比较

2.2 光学成像及透光率比较

SD大鼠脑切片在组织透明溶液中孵育3 d后，外观均呈透明状。利用体视显微镜对脑切片进行拍照也显示同样的结果。透过脑切片可见底部的网格线，可见试验组(图3A1)的脑组织透明度要优于对照组(图3A2)，对照组脑切片的脑室上方局部可见红斑。新西兰兔脑冠状切片在孵育3 d后外观也较透明，试验组(图3B1)整体透明度较高，与对照组(图3B2)相比效果更好，对照组局部有红色阴影，透光性较差。

利用紫外分光光度计对脑切片进行透光率检测，发现SD大鼠和新西兰兔的脑切片透光率均随着检测波长的增加而增大，试验组的透光率在同一波长下要大于对照组，且随着波长的增加有增大的趋势。将透光率绘制成曲线，发现试验组透光率曲线始终位于对照组曲线的上方(图3A3，图3B3)，且随着检测波长的增加两者之间透光率差距增大，进一步对不同波长下的透光率进行统计学分析发现，在850 nm和900 nm波长下，试验组的透光率与对照组透光率相比差异均显著(P<0.05)，在950 nm和1 000 nm波长下，试验组的透光率与对照组透光率相比差异极显著(P<0.01)。

2.3 免疫荧光和HE染色

免疫荧光结果显示，细胞均能较好的着色，可见血管内皮细胞围合的血管，试验组未观察到明显的绿色荧光(图4A1，图5A1)，对照组的切片血管内可见明显的绿色荧光，如箭头所示(图4B1，图5B1)。组织切片HE染色显示细胞形态正常，无明显肿胀，胞浆、胞核无共染，染色清晰且着色均匀，血管和红细胞形态易识别，试验组未观察到有红细胞(图4A2，图5A2)，而对照组可见红细胞，如箭头所示(图4B2，图5B2)。

A1.试验组鼠脑冠状切片(0.7×)；A2.对照组鼠脑冠状切片(0.7×)；A3.鼠脑透光率比较；B1.试验组兔脑冠状切片(0.8×)；B2.对照组兔脑冠状切片(0.8×)；B3.兔脑透光率比较。其中：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同

A1.试验组CD31标记血管内皮(绿色)，DAPI染核(蓝色)；A2.试验组HE染色；B1.对照组CD31标记血管内皮(绿色)，DAPI染核(蓝色)；B2.对照组HE染色

A1.试验组CD31标记血管内皮(绿色)，DAPI染核(蓝色)；A2.试验组HE染色；B1.对照组CD31标记血管内皮(绿色)，DAPI染核(蓝色)；B2.对照组HE染色

为了更准确地判定切片内红细胞数量，利用显微镜对所有HE染色的切片进行红细胞计数，将每张切片的红细胞个数进行统计，进一步分析发现，试验组红细胞数量与对照组相比均具有显著差异(P<0.05，图6)。

图6 不同灌注方法下红细胞数量比较

3 讨论

21世纪被称为“脑科学时代”，包括中国在内的很多国家相继提出“脑计划”，大脑的结构与功能也是科学家迫切希望掌握的重大问题之一，其对人类和动物疾病的诊断和治疗具有重要意义。组织透明技术作为一项新兴的技术，使科学家能够从器官尺度对动物大脑进行研究。经过透明技术处理的脑组织能真正意义上达到视觉透明效果，并借助光学仪器从整体上研究其内部复杂的结构和功能。组织的不透明源于组织对光的吸收和光的散射。组织内吸收可见光的主要分子是血红蛋白和肌红蛋白等，它们对光的吸收限制了光进入更深层组织，会影响组织透光率。当利用光学手段进行组织三维成像时，组织的空间分辨率和对比度大大降低。有文献报道可以使用双氧水处理样本使血红蛋白漂白或者将样本放于氨基乙醇的碱性溶液中洗脱除去血红素[5]。骨骼肌中的肌红蛋白也可以通过过氧化氢进行脱色。然而，过氧化氢等化学试剂可能会破坏组织的细胞结构，对荧光的保存也可能存在不利的影响[6-7]。此外，组织内部的自发荧光也会影响光学成像的结果。自发荧光源于组织内部的红细胞和一些固有荧光分子，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、胶原蛋白和酪氨酸等，也可能源于组织制备时产生的外源性荧光分子，比如组织在用醛类固定液固定后形成的席夫碱会增强自发荧光。宽波段的荧光会通过降低多个荧光通道的信噪比降低图像的质量，因此，要提高图像质量就必须减少组织自发荧光的干扰。目前有多种方法可以减少组织的自发荧光，据报道，Duong 等[8]发现在高强度照明下漂白组织可以减少组织的自发荧光；组织在经硼氢化钠处理后也可以消除席夫碱从而降低自发荧光[9]；另外，光谱分离法也可以去除宽波段的荧光信号[10]。而这些方法或多或少地会对组织造成破坏。

脑组织的灌注固定是动物组织病理试验中比较常规的操作技术，也是脑组织透明技术中的关键步骤，灌注固定效果的优劣直接影响后期标本的保存与制作。脑组织中红细胞灌流不充分不仅会影响光学成像深度，还会对免疫荧光染色产生较大干扰，最终影响组织光学成像效果[11]。将灌流固定液通过血管注入到动物体内是公认可行的操作。理论上，灌注液可以通过动物天然的血管通道较好地清除脑组织内部的血液。灌注一般是在动物麻醉状态下，经心脏用生理盐水或者PBS 对动物进行灌流，然后用多聚甲醛、甲醛等不同类型的固定液进行灌流固定，可有效避免抗原成分的丢失。由于血液循环系统的通路较多，根据其特点也衍生出不同的灌流方法，很多科技工作者都曾在灌注固定技术上进行研究和改进[12]。经心脏灌注的方法简单可行，易于掌握，目前被广泛使用[13]。然而，由于颈动脉起始端呈锐角且直径较小，会增大灌注阻力[14]。因此心脏灌注可能不太理想，尤其是动物体型较大时，弊端更为明显。因此，开发好的灌注方法是至关重要的，本试验尝试改进了脑组织的灌注方式。

本文介绍了经双侧颈总动脉灌注的方法，与传统心脏灌注方法相比，灌注路径较短，能有效减少灌注液和固定液的用量，节省灌注时间，能快速有效地灌注固定脑组织。在器官尺度上，用双侧颈动脉灌注的方法较传统的心脏灌注法得到的透明组织样本效果更佳，可以明显提高脑组织的透光率，对组织的透明具有一定的帮助。且在细胞水平上，该技术也能有效地减少脑组织内部的红细胞，可以减少红细胞自发荧光对组织一次甚至多次免疫标记荧光成像的干扰，为免疫荧光提供了更为干净的背景。目前，组织透明技术有很多种，包括高折射率的有机溶剂法(如BABB 和DBE等)和水溶性透明法(如Scales和SeeDB 等)[15-18]。科研人员主要集中在开发新的透明技术，很少有人注意到组织灌注固定的充分性可能影响组织的透光率。对初学者而言，大鼠和兔子颈总动脉的解剖位置查找、分离和插管可能有一定的难度，但经查阅资料、多次实践练习，该技术也能很好掌握，这对于快速灌注固定以及更有效地组织透明试验无疑是有益的。