灵芝粉枯草芽孢杆菌发酵条件的优化与质量检测

徐孝宙，胡元亮

(1. 南京农业大学，江苏 南京 210095;2. 江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400)

几千年前，微生物发酵已经在中国传统中药中得到应用。例如，六神曲、淡豆豉等中药都是由霉菌、酵母菌等微生物发酵而成。传统发酵中草药是将中药和辅料混合均匀，在温度、营养条件都适宜的前提下，经微生物发酵获得提高药效、改善药性、降低毒性的目的[1]。部分中草药的大量有效成分存在于细胞壁内，由于细胞壁结构紧密，细胞壁和细胞间质的双重阻碍等影响[2]，所以需要微生物产生的大量纤维素酶、半纤维素酶等多种胞外酶破坏细胞壁结构及细胞壁与细胞间质的阻碍，使中药的有效成分和活性物质有足够的、最大限度的提取[3]。宋艳秋等[4]对红曲霉转化中药葛根固态发酵条件的研究表明，利用发酵条件可以提高葛根中主要活性成分的含量，进一步说明利用微生物转化提高中药功效是可行的。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是芽孢杆菌属的一种，是一类内生芽孢的革兰阳性细菌[5]。该菌生理特征多样，在自然界中分布广泛，易于分离培养，对人畜无害，能分泌多种酶和抗菌肽等活性物质，具有良好的发酵性和抗逆性，应用广泛。枯草芽孢杆菌比其他益生菌更有优势，制备而成的微生态制剂具有：①能调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长和提高抗病力；②在不利环境条件下能以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持高活性；③能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高机体免疫力；④能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等，与内源消化酶共同发挥作用，促进养分消化吸收等优良特性[6]。闫凤兰等[7]以添加枯草芽孢杆菌的饲料饲喂肉仔鸡发现，枯草芽孢杆菌稳定性较好，并能起到抑制消化道中的大肠杆菌、沙门菌和促进乳酸杆菌生长的作用。枯草芽孢杆菌已被广泛应用于畜禽养殖、医药、植物生防等多个领域[8]。

灵芝，担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤灵芝和紫灵芝的总称，具有补中、固肾、补肺、止血的功效，对多种慢性病有一定疗效[9]。灵芝对人体具有双向调节作用，能治疗多种疾病，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等多个系统，特别对肿瘤、肝脏病变和失眠等的防治作用最为显著[10]。灵芝对于动物也具有较好的免疫调节活性，何嘉烽等[11]研究表明，给小鼠饲喂灵芝发酵干粉后，中、高剂量组小鼠的吞噬能力、脾淋巴细胞转化率、NK细胞的杀伤活性和血清溶血素含量显著提高，具有一定的调节免疫活性作用，发酵后的灵芝添加入饲料中，有利于畜禽的健康。范明君等[12]发现用灵芝菌糠饲料饲喂家禽、猪、反刍及水产动物，既能预防动物疾病、减少动物生产中抗生素的使用，同时还能促生长、降低饲养成本，证明了灵芝具有一定的开发价值和利用前景。本试验研究枯草芽孢杆菌发酵灵芝的最优条件，为进一步将灵芝发酵应用在动物生产中提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 灵芝

江苏农林职业技术学院江苏省食用菌研究所提供。将灵芝用粉碎机粉碎成蓬松的粉末状，倒入密封袋，标注日期，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.2 菌种来源

枯草芽孢杆菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏提供，编号：14246。40%无菌甘油-20 ℃冷冻保存的枯草芽孢杆菌，经牛肉膏蛋白胨液体肉汤2～3次传代，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.3 营养培养基

取牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g加纯净水1 000 mL加热搅拌，调pH值至7.2～7.4，加入琼脂25 g搅拌混匀，倒入锥形瓶，121.3 ℃高压灭菌15～20 min，倒入高温灭菌的培养皿制备牛肉膏蛋白胨培养基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。传代用液体培养基不加琼脂。

1.1.4 孟加拉红琼脂培养基

取蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、孟加拉红0.03 g、氯霉素0.1 g，调pH值至7.2～7.4，加入琼脂15 g搅拌混匀，倒入锥形瓶，121.3 ℃高压灭菌15～20 min，倒入高温灭菌的平板制备孟加拉红琼脂培养基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。

1.2 发酵条件的优化

1.2.1 活菌计数方法的优化

称取发酵后的灵芝粉末1 g，加入9 mL纯净水，震荡混匀。按10倍比稀释成6个阶梯浓度，分别取10-5、10-6稀释后的菌液0.1 mL，涂布到5个直径为9 cm的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，放入恒温培养箱培养18 h。观察固体培养基上芽孢杆菌的生长情况并计数菌落数。

称取发酵后的灵芝粉末各1 g，加入100 mL纯净水震荡混匀稀释至10-2，再按10倍比稀释成5个阶梯浓度，分别取10-5、10-6稀释后的菌液0.1 mL，涂布到5个直径为9 cm的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，放入恒温培养箱培养18 h。观察固体培养基上芽孢杆菌的生长情况并计数菌落数。

每克样品活菌数(CFU)=平均菌落数(CFU)×10×稀释倍数。其中，平均菌落数是指取菌落数20～200个的平板3个或3个以上，计数平板内菌落的平均数。

1.2.2 枯草芽孢杆菌接种比例的优化

采用单因素设计，分为3步：①选择最小接种比例。称取5组灵芝粉末各5 g，分别接种1、2、5、10 和20 mL枯草芽孢杆菌菌液，即菌液与灵芝粉之比分别为1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25，搅拌混匀，用封口膜封口，放入恒温培养箱37 ℃培养18 h，活菌计数。②测定不同接种比例下枯草芽孢杆菌的生长情况。称取5 g灵芝粉，分别滴入0.5、1和2 mL枯草芽孢杆菌菌液，即菌液与灵芝粉之比分别为1∶10、1∶5和1∶2.5，搅拌混匀，用封口膜封口，放入恒温培养箱37 ℃培养18 h，活菌计数。③验证最佳接种比例。称取50 g灵芝粉末，分别按比例滴入5、10和20 mL的枯草芽孢杆菌液，即菌液与灵芝粉之比分别为1∶10、1∶5和1∶2.5，搅拌混匀，用封口膜封口，37 ℃培养18 h，活菌计数。

小比例接种时，采用“等量递增法”混匀接种。例如：1∶10比例接种时，先用0.5 mL菌液接种于2 g灵芝粉末，再与5 g灵芝粉末混匀。

1.2.3 枯草芽孢杆菌发酵时间的优化

采取枯草芽孢杆菌菌液与灵芝粉末1∶5比例接种，恒温培养箱37 ℃分别培养16、18、20、22和24 h，活菌计数。

1.3 质量检测

1.3.1 发酵产物活菌计数

灵芝发酵产物置于干燥通风处放置，称取室温放置30 d的灵芝发酵产物1 g，按1.2.1方法操作，培养18 h，计数检测发酵产物中活芽孢杆菌数量。

1.3.2 霉菌检测

肉眼观察法：灵芝发酵产物置于干燥通风处放置30 d，肉眼观察发酵灵芝是否有霉菌生长。

平板计数法：按1.2.1方法操作，1 g发酵灵芝加入100 mL纯净水稀释到10-2，放入振荡培养箱均匀振荡，取稀释到10-3和10-4的菌液0.1 mL涂布于孟加拉红培养基，贴上封口膜，培养24 h，计数霉菌数量。

2 结果与分析

2.1 灵芝发酵条件的优化

2.1.1 活菌计数方法优化

发酵灵芝粉末1 g，加入9 mL纯净水，10倍比稀释取10-5、10-6稀释的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培养基上培养。活菌计数结果存在菌落数与稀释浓度不匹配的现象，如表1。分析原因认为灵芝粉为蓬松粉末，灵芝粉与水按1∶10混合，稀释混匀不充分，需提高稀释倍数。

发酵灵芝粉末1 g，加入100 mL纯净水，震荡混匀稀释至10-2，10倍比稀释取10-5、10-6稀释的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培养基上培养。活菌计数结果显示菌落数与稀释浓度呈正相关，如表1。

表1 优化前后菌落计数结果 个

2.1.2 接种量对芽孢杆菌含量的影响

最小接种量比例试验，5 g灵芝粉末按1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25接种枯草芽孢杆菌菌液，培养18 h均无肉眼可见霉菌生长，枯草芽孢杆菌活菌计数则随着接种量的增加而增长，呈线性关系。以1 mL菌液接种于5 g灵芝粉(1∶5)为最小接种比例活菌数量级达到108(图1)。

图1 不同接种比例枯草芽孢杆菌活菌数

最佳接种比例试验，5 g灵芝粉末按1∶10、1∶5和1∶2.5接种枯草芽孢杆菌菌液，结果显示活菌数与接种量呈线性关系。验证试验结果与之一致(图2)。

图2 最佳接种比例及验证结果

通过3次试验的对比与分析，综合生产成本等因素，优化选用1∶5接种枯草芽孢杆菌菌液，灵芝粉末发酵良好，节约原材料，降低生产成本。

2.1.3 发酵时间对芽孢杆菌含量的影响

按1∶5接种量比例，37 ℃培养16、18、20、22 和24 h。结果显示最佳发酵时间为22 h，培养20～24 h活菌数最多(图3)。

图3 不同发酵时间枯草芽孢杆菌活菌数

2.2 发酵产物活菌计数

室温放置30 d的灵芝发酵产物，菌落计数结果与细菌稳定期内计数无明显差异，活菌数为1×108CFU/g。

2.3 霉菌含量的计数

灵芝发酵产物室温放置30 d，观察结果显示无肉眼可见霉菌生长，孟加拉红培养基上也无霉菌生长。

3 讨论

灵芝粉粗纤维含量高，粉碎后直接饲喂动物适口性差，免疫活性物质吸收利用率低，益生菌发酵能提高灵芝的利用率。灵芝基础营养物质含量低，不利于乳酸杆菌等益生菌生长，枯草芽孢杆菌对营养及水分要求不高，利用枯草芽孢杆菌发酵灵芝可降解纤维素，还可以将部分大分子物质转化为可以直接吸收利用的小分子物质[13]。

枯草芽孢杆菌具有抗逆性强、对营养要求不严格的特性，在低营养的条件下，以芽孢形式休眠，在适宜条件下，芽孢会萌发繁殖生长[14]。因此本研究使用枯草芽孢杆菌为对象，开展灵芝发酵试验。固态发酵加水量少，发酵完成后，由于产品水分含量低，不易霉变，且枯草芽孢杆菌在利用灵芝的营养成分进行克隆繁殖，发酵产热，会进一步降低发酵物质的水分，制成预混料后，便于饲料混合。因而，本研究采用固态发酵形式。

通过枯草芽孢杆菌与灵芝粉的不同接种比例的摸索，结果表明枯草芽孢杆菌在低接种比例时，具有较好的发酵效果，凸显枯草芽孢杆菌的优良生长特性。枯草芽孢杆菌菌液按1∶5接种于粉碎的灵芝，其适应期8～10 h，培养10 h进入对数生长期。芽孢杆菌在适宜条件下，如在液态营养琼脂培养基中，其适应期约为6 h[15]。由于固态发酵中水分和营养成分均低于营养琼脂，本次试验中芽孢杆菌在灵芝发酵中的适应期延长。后进入对数生长期，至培养22 h，随着灵芝中的营养成分被枯草芽孢杆菌所利用，细菌生长进入稳定期，数量不再上升。

徐亚英等[16]研究表明，枯草芽孢杆菌液发酵最佳温度范围为32～37 ℃，对营养含量高利于发酵与产热的基质，可以选择32 ℃发酵，而灵芝营养物质含量低，发酵过程中产热量少，当发酵温度是37 ℃时，其菌体生长量达到最高；温度高于或低于37 ℃，含菌数都有所下降。本研究选用37 ℃发酵温度达到满意的效果。

4 结论

本研究枯草芽孢杆菌固态发酵灵芝表明，1∶5接种比例，37 ℃发酵22 h，至发酵完成枯草芽孢杆菌的活菌数可达到1.0×108CFU/g，符合国家农业行业标准的要求(NY/T1461—2007)。固态发酵接种活菌量少，在满足细菌生长的同时节约了成本；同时固态发酵产物易于干燥与保存，常温下保存不易发霉，利于畜牧业的运输与应用。但灵芝本身成本较高，如何去降低成本适应用量大、成本低的畜牧业应用需求，或应用于高回报的领域尚需进一步深入研究。