miR-20b-5p靶向调控Cyclin D1对NSCLC细胞生物学行为的影响

刘彦军，姚四清，李毅

运城市中心医院胸外科，山西运城044099

肺癌是临床常见的呼吸系统恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的主要原因［1］。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的病理类型，占肺癌总数的80%以上，其预后较差，5年生存率较低［2］。但目前NSCLC发病的分子机制尚不完全清楚。miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，能够通过与靶基因3′非翻译区（3′UTR）互补结合，在转录后或翻译水平上负调控基因表达。miRNA功能异常是恶性肿瘤发生的重要因素。miRNA可作为癌基因或抑癌基因，参与恶性肿瘤的发生、发展。许多研究证实，miRNA能够通过调控细胞增殖、分化、迁移等生物学行为，参与NSCLC的发生、发展［3-5］。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是细胞周期的重要调节剂，通常在恶性肿瘤组织中过表达，是恶性肿瘤表型和疾病进展的生物标志物［6-7］。XIA等［8］研究发现，在乳腺癌细胞中miR-20b-5p异常表达，其异常表达可能通过调控Cyclin D1和E2F转录因子1表达，促进乳腺癌干细胞恶性生物学行为，提示miR-20b-5p可能通过靶向调控Cyclin D1参与乳腺癌的发生、发展。但在NSCLC细胞中miR-20b-5p与Cyclin D1的关系尚不明确。2019年6月—2020年12月，本研究观察了miR-20b-5p靶向调控Cyclin D1对NSCLC细胞生物学行为的影响及其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC细胞系A549、H1975、PC-9（以下称A549、H1975、PC-9细胞）及人正常肺上皮细胞BEAS-2B（以下称BEAS-2B细胞），购自中国科学院上海细胞生物学研究所。miR-20b-5p模拟物（miR-20b-5p mimic）及其阴性对照物（miR-NC）、Cyclin D1干扰质粒（si-Cyclin D1）及其阴性对照质粒（si-NC），由北京华大基因研究中心有限公司设计合成。所有引物序列由武汉金开瑞生物工程有限公司设计合成。Cyclin D1基因相关的双荧光素酶质粒（野生型WT、突变型MT），购自湖南丰晖生物科技有限公司。PTC-200型PCR仪，购自美国BIO-RAD公司；酶标仪，购自美国Thermo Fisher公司；凝胶成像系统，购自美国ProteinSimple公司；Transwell小室，购自美国Corning公司。双荧光素酶活性检测试剂盒，购自美国Promega公 司；Prime ScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix EX Taq，购自日本TaKaRa公司；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒，购自江苏碧云天生物技术有限公司。Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1、β-actin一抗及其相应二抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 NSCLC细 胞 筛 选 A549、H1975、PC-9和BEAS-2B接种于含10%FBS的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。待细胞生长融合至80%左右时，按1∶4传代。取传4代、对数生长期、生长状态良好的NSCLC细胞和人正常肺上皮细胞各2×105个，按总RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按Prime ScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：37℃15 min，85℃5 s。以cDNA为模板，按SYBR Premix EX Taq说明进行PCR扩增。引物序列：miR-20b-5p上游引物5′-UCGGGGU⁃CAAUCGCUUGCGU-3′，下游引物5′-GGUCGUGC⁃GUACUGGUUGCA-3′；U6上 游 引 物5′-UGCAU⁃CAUGCUCGUCAUGGCCGUAG-3′，下 游 引 物5′-UGCUAGCUGGCUAGCAACGUGCAC-3′。PCR扩增体系共25μL：模板DNA 1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，ddH2O 17.25μL；反应条件：95℃5 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-20b-5p相对表达量。选择miR-20b-5p相对表达量最低的NSCLC细胞进行后续实验。

1.3 miR-20b-5p靶向调控Cyclin D1预测与验证借助Starbase数据库，预测miR-20b-5p与Cyclin D1的结合位点。根据突变位点分别设计野生型和突变型，以NSCLC细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增分别获取野生型和突变型序列，连接至野生型Cyclin D1 3′UTR（Cyclin D1 WT）和突变型Cyclin D1 3′UTR（Cyclin D1 MT）。将NSCLC细胞接种于12孔板，随机分为Cyclin D1 WT组、Cyclin D1 WT+miR-20b-5p mimic组、Cyclin D1 MT组、Cyclin D1 MT+miR-20b-5p mimic组。当细胞生长融合80%左右时，Cyclin D1 WT组转染Cyclin D1 WT，Cyclin D1 WT+miR-20b-5p mimic组转染Cyclin D1 WT和miR-20b-5p mimic，Cyclin D1 MT组转染Cyclin D1 MT，Cyclin D1 MT+miR-20b-5p mimic组转染Cyclin D1 MT和miR-20b-5p mimic。转染48 h，收集细胞，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测各组荧光素酶活性。

1.4 细胞转染与转染效率验证 取传4代、对数生长期、生长状态良好的NSCLC细胞，接种于6孔板，每孔4×105个，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养24 h，随机分为对照1组、miR-NC组、miR-20b-5p mimic组以及对照2组、si-NC组、si-Cyclin D1组，按Lipofeetamine2000说明，miR-NC组与miR-20b-5p mimic组分别转染miR-NC、miR-20b-5p mimic质粒，si-NC组与si-Cyclin D1组分别转染si-NC、si-Cyclin D1质粒，对照1组与对照2组不予转染。转染6 h，更换新的培养基，继续培养48 h，收集细胞，采用RT-qPCR法检测转染效率。

1.5 细胞存活率检测 采用MTT法。收集上述miR-NC组与miR-20b-5p mimic组、si-NC组与si-Cyclin D1组细胞，按5×103个/孔密度接种于96孔板，另设空白对照组（不加入细胞），置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4 h。弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，充分混匀，使结晶物充分溶解。酶标仪于570 nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值。细胞存活率=（实验组OD值－空白对照组OD值）/（对照组OD值－空白对照组OD值）×100%。

1.6 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。收集上述miR-NC组与miR-20b-5p mimic组、si-NC组与si-Cyclin D1组细胞，以3×105个/孔密度接种于6孔板，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养48 h，转移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清。每管加入Annexin V-FITC结合液500μL重悬，然后加入Annexin V-FITC 5μL、PI 10μL，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.7 细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室实验。收集上述miR-NC组与miR-20b-5p mimic组、si-NC组与si-Cyclin D1组细胞，胰蛋白酶消化后制成密度为1×105个/mL的细胞悬液。取细胞悬液200μL加入Transwell小室上室，下室加入含10%FBS的RPMI 1640培养基500μL。然后将Transwell小室置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养48 h，取出Transwell小室，轻轻拭去上室面未穿膜细胞，多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色10 min，倒置相差显微镜下拍照观察。随机选取5个不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1.8 细胞周期检测 采用流式细胞术。取上述miR-NC组与miR-20b-5p mimic组、si-NC组与si-Cyclin D1组细胞，以2×104个/孔密度接种于6孔板，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养48 h，转移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入预冷的70%乙醇固定24 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清。每管加入染色缓冲液500μL、20×PI 25μL、50×RNase 10μL重悬，37℃避光染色30 min，上流式细胞仪检测。

1.9 Cyclin D1、CDK4、FOXM1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取上述miR-NC组与miR-20b-5p mimic组、si-NC组与si-Cyclin D1组细胞，以4×105个/孔密度接种于6孔板，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。常规培养48 h，转移至15 mL离心管，4℃下4 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。经BCA法蛋白定量合格，加入等量loading buffer，100℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30μg，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。1%BSA室温封闭2 h，分别加入Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1、β-actin一抗，4℃孵育过夜。次日，加入相应的二抗，室温孵育1 h。ECL化学发光，暗室中曝光、显影。Amersham Imager 600凝胶成像系统拍照。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两样本均数比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC细胞与人正常肺上皮细胞miR-20b-5p表达比较 BEAS-2B、H1975、PC-9、A549细胞miR-20b-5p相对表达量分别为1.00±0.12、0.48±0.11、0.46±0.11、0.32±0.08。H1975、PC-9、A549细胞mi R-20b-5p相对表达量均低于BEAS-2B细胞，并且A549细胞miR-20b-5p相对表达量低于H1975、PC-9细胞（P均<0.05）。因此，选择A549细胞进行后续实验。

2.2 miR-20b-5p与Cyclin D1的靶向调控关系 经Starbase数据库预测，miR-20b-5p与Cyclin D1存在靶向结合位点，见图1。Cyclin D1 WT组、Cyclin D1WT+mi R-20b-5p mimic组、Cyclin D1 MT组、Cyclin D1 MT+mi R-20b-5p mimic组荧光素酶活性分别为3.24±0.52、1.41±0.13、3.19±0.47、3.30±0.47，Cyclin D1WT+miR-20b-5p mimic组荧光素酶活性均低于其他三组（P均<0.05），而其他三组荧光素酶活性两两比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。

图1 mi R-20b-5p与Cyclin D1的靶向结合位点示意图

2.3 各组转染效率验证结果 对照1组、miR-NC组和miR-20b-5p mimic组miR-20b-5p相对表达量分别为0.35±0.07、0.40±0.09、1.14±0.21，miR-20b-5p mimic组miR-20b-5p相对表达量高于对照1组和miR-NC组（P均<0.05），而对照1组与miR-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。对照2组、si-NC组和si-Cyclin D1组Cyclin D1相对表达量分别为2.14±0.15、2.23±0.19、0.87±0.08，si-Cyclin D1组Cyclin D1相对表达量低于对照2组和si-NC组（P均<0.05），而对照2组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 各组细胞存活率、细胞凋亡率、穿膜细胞数以及细胞周期比较 见表1、2。

表1 mi R-NC组与miR-20b-5p mimic组细胞存活率、细胞凋亡率、穿膜细胞数以及细胞周期比较（±s）

表1 mi R-NC组与miR-20b-5p mimic组细胞存活率、细胞凋亡率、穿膜细胞数以及细胞周期比较（±s）

注：与miR-NC组比较，*P<0.05。

组别mi R-NC组mi R-20b-5p mimic组细胞存活率（%）97.6±2.6 53.6±4.2*细胞凋亡率（%）4.2±0.4 25.6±6.7*穿膜细胞数（个）35.1±3.5 12.6±2.7*细胞周期（%）G0期20.3±2.8 19.5±2.4 G1期58.4±6.2 74.2±7.2*G2/M期22.7±3.1 6.2±1.2*

表2 si-NC组与si-Cyclin D1组细胞存活率、细胞凋亡率、穿膜细胞数以及细胞周期比较（±s）

表2 si-NC组与si-Cyclin D1组细胞存活率、细胞凋亡率、穿膜细胞数以及细胞周期比较（±s）

注：与si-NC组比较，*P<0.05。

组别si-NC组si-Cyclin D1组细胞存活率（%）98.2±3.1 64.3±3.5*细胞凋亡率（%）4.5±0.7 23.7±5.2*穿膜细胞数（个）36.4±3.6 15.3±2.8*细胞周期（%）G0期20.6±2.6 21.0±2.4 G1期58.6±5.1 71.0±7.6*G2/M期23.5±3.3 7.6±1.8*

2.4 各组Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白表达比较 见表3、4。

表3 miR-NC组与miR-20b-5p mimic组Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相对表达量比较（±s）

表3 miR-NC组与miR-20b-5p mimic组Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与miR-NC组比较，*P<0.05。

组别mi R-NC组mi R-20b-5p mimic组Cyclin D1 0.93±0.09 0.21±0.02*CDK4 0.85±0.07 0.25±0.03*FOXM1 0.96±0.10 0.95±0.13 p-FOXM1 0.89±0.08 0.42±0.07*

表4 si-NC组与si-Cyclin D1组Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相对表达量比较（±s）

表4 si-NC组与si-Cyclin D1组Cyclin D1、CDK4、FOXM1、p-FOXM1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与si-NC组比较，*P<0.05。

组别si-NC组si-Cyclin D1组Cyclin D1 0.91±0.07 0.23±0.02*CDK4 0.89±0.07 0.21±0.03*FOXM1 0.94±0.12 0.95±0.11 p-FOXM1 0.83±0.05 0.20±0.02*

3 讨论

据报道，2019年美国肺癌新发病例超过22万例，占所有新发恶性肿瘤的13%［9］。由于肺癌早期症状隐匿且缺乏特异性，多数患者就诊时已处于中晚期，错过了根治性手术的最佳时机，预后较差。有研究报道，早期肺癌患者5年生存率可达到70%，而晚期肺癌患者仅20%甚至更低［10］。目前，NSCLC的发病机制尚不完全清楚。因此，进一步研究NSCLC发病的分子机制，从而探索肿瘤早期诊断和靶向治疗的生物标志物具有重要意义。

miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的内源性小分子非编码RNA，在肿瘤的发生、发展过程中起着至关重要的作用。miR-20b-5p定位于人染色体Xq26.2，该区域与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关［11］。miR-20b-5p在多种恶性肿瘤中异常表达，可作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等。目前，miR-20b-5p在NSCLC中的作用尚不明确。ARORA等［12］研究发现，miR-20b-5p在NSCLC组织中表达下调，其表达越低，患者5年生存率越低，提示miR-20b-5p在NSCLC中可能发挥抑癌基因作用。ZHANG等［13］研究报道，与健康志愿者比较，NSCLC患者外周血中循环外泌体miR-20b-5p水平降低，并且miR-20b-5p可作为非侵入性早期诊断NSCLC的生物标志物。PENG等［11］研究表明，miR-20b-5p在NSCLC组织和细胞系中表达降低，并能通过靶向B细胞易位基因3抑制NSCLC细胞增殖和迁移，有可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。本研究结果发现，与人正常肺上皮细胞相比，NSCLC细胞miR-20b-5p表达降低，提示miR-20b-5p在NSCLC中可能发挥抑癌基因作用。在H1975、PC-9、A549细胞中，A549细胞miR-20b-5p表达最低，故选择A549细胞进行后续实验。本研究利用瞬时转染技术上调A549细胞miR-20b-5p表达，结果发现A549细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞迁移能力降低，G1期细胞比例增加、G2/M期细胞比例降低，进一步证实mi R-20b-5p在NSCLC中发挥抑癌基因作用，与以往报道［11-13］一致。

miR-20b-5p能够通过MAPK信号通路、p53信号通路、血管内皮生长因子信号通路等，参与细胞周期调控。Cyclin D1是细胞周期的重要调节剂。Cyclin D1能够通过CDK4、CDK6的变构调节剂，影响细胞周期从G1期到S期转变。活跃的Cyclin D1/CDK4复合物易位至细胞核，与细胞周期蛋白E/CDK2一起磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白，并消除对E2F转录因子的抑制作用，从而影响肿瘤细胞增殖。Cyclin D1/CDK4/6复合物能够使某些转录因子磷酸化，从而激活或抑制细胞周期进程所需基因的表达。Cyclin D1表达下调，上皮细胞和巨噬细胞的迁移能力亦随之降低。有研究报道，在转基因小鼠中Cyclin D1通过CDK4/6依赖性机制驱动甲状旁腺瘤形成，而Cyclin D1过表达的甲状旁腺细胞可能对CDK4/6抑制剂特别敏感，提示Cyclin D1过表达的晚期甲状旁腺癌患者可接受CDK4/6抑制剂治疗［14］。本研究结果发现，miR-20b-5p与Cyclin D1存在靶向调控关系；利用瞬时转染技术敲低A549细胞Cyclin D1表达，结果发现A549细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞迁移能力降低，G1期细胞比例增加、G2/M期细胞比例降低。结果提示miR-20b-5p与Cyclin D1有可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。

FOXM1参与细胞周期从G1期至S期的转变，能够保护肿瘤细胞免于衰老，从而促进肿瘤进展［15］。FOXM1在肝细胞癌、肺腺癌、胃癌等恶性肿瘤转移过程中起着至关重要的作用。有研究报道，在黑色素瘤细胞中CCND1-CDK4/6复合物能够促进FOXM1磷酸化，从而促进肿瘤恶性进展［16］。CDK4在对常规放疗和化疗有抵抗的恶性骨肉瘤中表达增加，并且其表达增加与患者高转移率和预后不良有关［17］。本研究通过上调miR-20b-5p表达或敲低Cyclin D1表达，A549细胞Cyclin D1、CDK4、p-FOXM1蛋白相对表达量均明显降低，说明miR-20b-5p靶向调控Cyclin D1的分子机制可能与Cyclin D1/CDK4/FOXM1信号通路有关。

综上所述，miR-20b-5p通过靶向调控Cyclin D1促进NSCLC细胞增殖和侵袭，抑制其凋亡并将细胞阻滞于G1期，其作用机制可能与调控Cyclin D1/CDK4/FOXM1信号通路有关。