脑心舒口服液中10-羟基-2-癸烯酸、苯甲酸含量测定及质量评价

刘灿黄，何清彦，吴胜男，刘波，林新文，蒋桃

1.长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410208；2.湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，湖南 长沙 410013；3 湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410208

脑心舒口服液是滋补镇静安神类中成药，用于身体虚弱、心神不宁、失眠多梦、神经衰弱、头痛眩晕等，尤其在顽固性神经衰弱方面疗效显著［1］。国家药品监督管理局网站上可以查询到101 条“脑心舒口服液”批准文号，脑心舒口服液是典型的“一品多家”中成药品种。网上销售价格0.5～3.0 元/支，价格相差近6 倍。脑心舒口服液由蜜环菌浓缩液和蜂王浆组成，其制法是取蜂蜜加热炼制，滤过，放冷，与研磨好的蜂王浆混匀，再加入蜜环菌浓缩液，苯甲酸钠及香精的乙醇液，混匀，调整总量，搅匀，滤过，即得。主要成分蜜环菌是天麻的共生菌，与天麻有相似的生物活性，有明显的镇静安眠作用［2］；蜂王浆是集营养、食疗及保健多位一体的天然物质，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节免疫及护肤美容等多方面药理作用。蜂王浆有效成分10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王浆特有的脂肪酸，俗称王浆酸，是蜂王浆的标志物［3］。

脑心舒口服液目前质量标准主要有国家药品监督管理局国家药品标准 WS3-B-3975-98-2002、WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、国家药品监督管理总局国家药品标准 WS3-B-3975-98-2002-1、国家药品监督管理局标准（试行）YBZ27332005。处方制法均一致，但各标准均不相同。大部分生产企业执行的是国家药品监督管理局国家药品标准WS3-B-3975-98-2002［4］，标准中含化学、薄层鉴别、相对密度、pH 值、装量、微生物限度等检查项，无含量测定项。本文就湖南省2020 年抽检的流通环节全部执行WS3-B-3975-98-2002 标准的6 个厂家11 批脑心舒口服液进行质量分析，对其有效成分10-羟基-2-癸烯酸和防腐剂苯甲酸进行定量探索研究［5-10］，为其成药整体质量评价和标准提升提供研究基础，为该品种的质量监管提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20AD 高效液相色谱仪，SPD-M20A检测器，SIL-20A 自动进样器，LC solution 色谱工作站，电子天平 METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超声仪。

1.2 试药

10-羟基-2-癸烯酸（批号：110812-201808，97.5%），苯甲酸（批号：100419-201703，99.9%），对照品均购自中国食品药品检定研究院；试剂甲醇、磷酸均为分析纯，水（超纯水），乙腈（色谱纯）。脑心舒口服液样品信息如下，按标准检验均合格，结果见下表1。

表1 样品信息及按标准检测指标结果

2 方法与结果

2.1 色谱条件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）为流动相，流速1.0 mL/min；柱温35 ℃，波长207 nm 测定10-羟基-2-癸烯酸，230 nm 处测定苯甲酸，进样量10 μL；分析时间40 min。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图：A.10-羟基-2-癸烯酸对照品（207 nm）；B.苯甲酸对照品（230 nm）；C.样品（207 nm）；D.样品（230 nm）

2.2 对照品溶液的制备

精密称取10-羟基-2-癸烯酸对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度为10 μg/mL 的对照品溶液。精密称取苯甲酸对照品适量，至棕色量瓶中，加甲醇制成浓度为50 μg/mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品2 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系取混合对照品溶液2，5，10，15，20，25 μL 在上述色谱条件分别进样，测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），相应对照品峰面积为纵坐标（Y），求得10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸的回归方程分别为Y=1.16×106X+388.14（r=0.999 7）；Y=1.07×106X+4 743（r=0.999 1），结果表明，10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸进样量分别在0.02～0.25 μg，0.10～1.25 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 重复性试验取同一批号的脑心舒口服液样品，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样，计算10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸含量的RSD 分别为1.4%，1.1%。结果表明，方法重复性良好。

2.4.3 精密度试验取混合对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6 次，每次10 μL，计算10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸色谱峰面积的RSD 分别为0.7%，1.0%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取同一批号的脑心舒口服液样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h，在上述色谱条件下分别进样，计算10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸色谱峰面积的RSD 别为1.3%，0.8%。结果表明，样品溶液在24 h 内稳定。

2.4.5 回收率试验取已知含量（10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量分别为0.199 mg/mL，2.246 mg/mL）的脑心舒口服液6 份，每份精密量取1 mL，每份精密加入含10-羟基-2-癸烯酸对照品储备液（浓度为0.1 mg/mL）1 mL 和苯甲酸对照品储备液（浓度为0.5 mg/mL）4 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。结果10-羟基-2-癸烯酸及苯甲酸的平均回收率分别为99.01%，100.13%，RSD 分别为1.2%，0.9%。

2.5 样品含量测定

分别取脑心舒口服液按“2.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下进样分析，于207 nm 检测10-羟基-2-癸烯酸，230 nm 检测苯甲酸，测定峰面积，计算10-羟基-2-癸烯酸和苯甲酸的含量，并按原料蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸100%转移折算，计算原料蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸含量。测定结果分别见表2。

表2 样品含量测定结果（n=2）

2.6 样品聚类分析

聚类分析是一种通过数据建模简化数据的方法，依据研究对象的某些特征加以归类，建立样本间的相似关系，现已广泛应用于中药及其制剂的质量评价中。采用TBtools 进行聚类热图分析，其中横向聚类样品，纵向聚类色谱峰，热图颜色代表峰面积，热图分析结果显示11 批样品化学成分比例有差异：3 号峰为苯甲酸，热图颜色可直观显示企业A 中S5 号样苯甲酸含量最低，因而偏离同企业其他批次样品；7 号峰为10-羟基-2-癸烯酸，企业E（S9）和企业F（S11）样品中10-羟基-2-癸烯酸含量比较低；峰1、2、4、5、6 在各样品中差异较大，峰1、峰4 成分在企业A（S1、S2、S3、S4、S5）、企业B（S6、S10）、企业D（S8）中含量很低，峰2 成分在企业D（S8）、企业E（S9）、企业F（S11）中含量很低，峰5、峰6 成分在企业F（S11）中含量最低，其次在企业D（S8）中含量也很低。样品热图聚类分析结果表明相同生产企业的样品质量一致性相对较好，而不同生产企业的样品间的质量一致性较差。因脑心舒口服液生产工艺简单，无提取过程只有简单的混合工序，质量差异主要来源于其原料蜜环菌、蜂王浆、蜂蜜、防腐剂的差异。分析图见图2。各企业色谱图见图3。

图2 聚类热图分析图

图3 企业A、B、C、D、E、F样品色谱图（207 nm）

3 讨论

3.1 成分分析

6 家企业11 批样品全部执行的是国家药品监督管理局国家药品标准 WS3-B-3975-98-2002，标准中按化学反应、薄层鉴别、相对密度、pH 值、装量、微生物限度检查项检验全部合格，但是产品中有效成分10-羟基-2-癸烯酸含量差别较大，最高达2.36 mg/支，最低只有0.44 mg/支，而标准WS-11356（ZD-1356）-2002-2012Z、WS3-B-3975-98-2002-1 中分别规定10-羟基-2-癸烯酸含量不得低于2.0 mg/支、2.5 mg/支，而本次流通环节抽检的6个厂家11 批产品中10-羟基-2-癸烯酸含量全部低于2.5 mg/支，3 个厂家4 批次产品低于2.0 mg/支，说明执行WS3-B-3975-98-2002 标准的脑心舒口服液产品有效成分10-羟基-2-癸烯酸含量普遍偏低。GB9697-2008《蜂王浆》国家标准强制性要求理化指标10-羟基-2-癸烯酸≥1.4%为合格品，≥1.8%为优等品。ISO12824《蜂王浆》国际标准要求10-羟基-2-癸烯酸≥1.4%。脑心舒口服液处方工艺较为简单，按原料蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸100%转换折算，11 批产品中原料蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸含量最高0.94%，最低只有0.18%，普遍含量偏低。10-羟基-2-癸烯酸有多种药理活性作用，又是蜂王浆中特征性成分，是衡量蜂王浆品质的重要理化指标。此结果表明脑心舒口服液中原料蜂王浆质量参差不齐。脑心舒口服液生产中无提取过程，只有简单的混合工序，样品间的差异主要来源于原料的差异。聚类分析显示，各企业间产品色谱峰信息差异较大，表明不同生产企业脑心舒口服液原料蜜环菌、蜂王浆、蜂蜜等质量的差异。成品执行质量标准太低，无法有效控制脑心舒口服液的质量，脑心舒口服液的质量标准亟待完善和提升。

3.2 防腐剂苯甲酸含量分析

防腐剂抑制微生物的生长和繁殖，延长药品的保存期限，但过量摄入防腐剂会对人体产生危害，如苯甲酸类对咽喉、胃黏膜均有一定的刺激性。口服液体制剂通常选用苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酯类防腐剂，苯甲酸的用量不得超过0.3%（钾盐、钠盐用量分别按酸计），脑心舒口服液中加防腐剂苯甲酸钠，本实验测得苯甲酸钠（以苯甲酸计）含量0.13%～0.22%，均低于0.3%，其中8 批产品苯甲酸含量0.20%～0.22%，均符合要求。WHO 规定苯甲酸日允许总摄入量为5 mg/kg 。GB2760-2011 食品添加剂使用标准中苯甲酸浓缩果蔬汁（仅限食品工业用）中限度为0.2%，其余酱油、醋、风味饮料限度为0.1%，其他果酒、配制酒限度为0.08%、0.04%。所以脑心舒口服液作为滋补强壮、镇静安神滋补类药物，其用量一定严格按照说明书用法用量服用（口服，一次10 mL，一日3 次）［10］，不可当普通营养液超剂量随意服用。作为滋补常用药品，生产企业有待对产品原有老工艺用的防腐剂类型和质量进一步优化。