HPLC 法同时测定六味安消片中大黄素、大黄酚及没食子酸的含量

郭新强，姜军华

1.江西省樟树市药品检验所，江西 樟树 331200；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

六味安消片在六味安消胶囊基础上改剂型而来［1］，是由土木香、大黄、山柰、寒水石（煅）、诃子、碱花6 味药加工而成的复方制剂，方中土木香健脾和胃、行气止痛，为君药；大黄攻积导滞，且能活血化瘀，辅助君药行气导滞止痛，为臣药；诃子涩肠止泻，以防泻下太过伤正，与山柰、寒水石（煅）、碱花共为佐药，诸药相合，共奏和胃健脾，消积导滞，活血止痛之功。六味安消片在临床用于治疗慢性胃肠炎，便秘等［2-3］。该制剂标准为：国家食品药品监督管理局药品标准YBZ12202006-2009Z。现行标准含量测定方法过于复杂，且只控制了大黄一味药的含量，故本研究采用HPLC 法同时测定六味安消片中没食子酸、大黄素及大黄酚的含量测定，能同时控制诃子和大黄的含量，可为六味安消片的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-20AD 高效液相色谱仪，岛津Lab Solutions 工作站，PDA 检测器；色谱柱：ACE Excel 5 C18-AR 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ-500E型超声清洗器；ML204 型电子天平（梅特勒）；德国赛多利斯Secura 125-1CN 分析天平（十万分之一）。

没食子酸（批号：110831-201906）、大黄素（批号：110756-201913）和大黄酚（批号：110796-201922），含量分别为 91.5 %、96.0%和 99.4%，均购自中国食品药品检验研究院。六味安消片为薄膜衣片，规格为0.51 g/片，为江西博士达药业有限责任公司生产，批号分别为：171102、171103、171106、171201、171205、171209；阴性样品：取缺诃子、大黄的其余各药材，按处方量及工艺自制阴性；水为超纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 5 C18-AR 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙腈,流动相B：0.1%磷酸溶液。梯度洗脱（0～8 min，5%～8%A；8～9 min，8%～85%A；9～30 min，85%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：254 nm。理论塔板数按没食子酸峰计算不低于3 000。

1.3 溶液的制备

1.3.1对照品溶液 分别精密称取没食子酸、大黄素和大黄酚适量，加甲醇制成每1 mL 含没食子酸65 μg、大黄素5 μg、大黄酚10 μg 的混合溶液，即得。

1.3.2 供试品溶液取六味安消片10 片，除去包衣，精密称定，置于研钵中研细，取约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密量取甲醇25 mL 加入锥形瓶中，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）1 h，放冷，再进行称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

1.3.3 阴性对照品溶液取自制阴性样品，按“1.3.2”方法制备缺大黄和诃子的溶液，用微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性试验分别取混合对照溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，结果见图1。由图可知，各成分色谱峰分离效果佳，分离度均大于1.5，阴性样品在三种待测成分位置处无干扰［4-6］，说明该方法专属性佳。

图1 专属性试验的HPLC色谱图

2.1.2 线性关系的考察分别精密吸取“1.3.1”中三种组分的混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL 依次进行测定，用岛津高效液相色谱仪进行分析，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1，三种成分在各自范围内呈良好的线性。

表1 三种成分线性关系

2.1.3 精密度试验精密吸取“1.3.1”中三种成分混合对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，计算各组分峰面积的RSD，测得没食子酸、大黄素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.17%、0.27%、0.17%。

2.1.4 稳定性试验取“1.3.2”项制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20 h 进行测定，测得没食子酸、大黄素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.50%、0.35%、0.21%（n=6），表明样品溶液制备后20 h内基本稳定。

2.1.5 重复性试验取同一批薄膜衣片（批号：171103），按“1.3.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，照“2.1”项下方法，依法测定，测得没食子酸、大黄素、大黄酚含量结果RSD 分别为1.32%、0.51%、1.16%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验取同一批薄膜衣片（批号：171103）适量，除去包衣，精密称定，置研钵中研细，平行取样6 份，每份0.25 g，精密称定，分别置锥形瓶中，精密加入含适量混合对照品的甲醇溶液（没食子酸浓度0.045 33 mg/mL、大黄素浓度0.003 454 mg/mL、大黄酚0.006 214 mg/mL）25 mL，照“1.3.2”项下方法试验，照“2.1”项下方法，依法测定，结果测得没食子酸平均加样回收率为101.32%，RSD1.13%（n=6），大黄素平均加样回收率为98.42%，RSD1.95%（n=6），大黄酚平均加样回收率为100.12%，RSD1.25%（n=6），适合本品的含量测定。

2.2 样品测定

分别对收集的6 批六味安消片，采用“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法进行测定，测定结果见表2。

表2 三种成分含有量测定结果（mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 提取方法的比较

方中臣药大黄主要含有大黄素、大黄酚等蒽醌衍生物［7-12］，以少部分游离性、大部分结合型蒽醌存在。测定“总大黄素和总大黄酚的总量”时存在水解产生的杂质在部分色谱柱上会与大黄素共同流出［13-14］，存在干扰,导致测定的含量异常偏高，测定总蒽醌时提取繁琐，分析时为防止水解杂质干扰，分析时间长。而采用超声提取，这些缺陷均得以克服。

3.2 流动相的选择

比较了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水三种流动相，发现前2种流动相均可以得到较好分离，无需采用甲醇-乙腈-水三相进行分离。同时发现采用乙腈-0.1%磷酸溶液峰形在三者中最佳。综合考虑，选用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱分离三种成分。

3.3 检测波长的筛选

本试验采用PDA 检测器，在紫外光区（190～400 nm）对所测成分进行光谱扫描。结果没食子酸在217 nm 波长处有最大吸收，但为末端吸收,样品中峰杂质大，而大黄素及大黄酚检测波长在254 nm处有最大吸收，而没食子酸在254 nm 下吸收较大，故最终确定作为三者的检测波长。

4 结论

采用HPLC 法同时对六味安消片中没食子酸、大黄素、大黄酚进行含量测定。该方法准确度高、操作简便、重现性好，为六味安消片提供了多指标质量控制依据。