褐藻胶裂解酶研究进展

吴阳，霍峥，李刚，温少红

烟台大学生命科学学院（烟台 264000）

褐藻胶存在于褐藻细胞壁及细胞间质中，约占其干重的40%。褐藻胶是酸性阴离子线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate；M）和与其C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronate；G）通过1,4糖苷键共价连接，以均聚或随机的方式排列成同源多糖醛酸M残基（Poly M）、G残基（Poly G）以及杂多糖醛酸（Poly MG或Poly GM）[1]。除褐藻外，褐藻胶也由两个细菌属——固氮菌（例如葡萄固氮菌Azotobactersp.）和几种假单胞菌产生（例如铜绿假单胞菌Pseudomonosasp.）。

褐藻寡糖（AOS）由褐藻胶降解产生，除保留褐藻胶的优良特性外还具有特殊的化学特性及生物活性，具有更广泛的应用价值。在食品方面作为食品添加剂，农业方面作为植物生长促进剂和治疗剂，医药方面具有抗氧化和抗肿瘤等特性，在能源方面将褐藻胶降解为寡糖是将其直接转化为乙醇的关键步骤[2-5]。

褐藻胶的降解方法有物理法、化学法和酶解法。酶解法具有底物专一、反应条件温和等优点，还可以定向制备褐藻寡糖，相较于物理、化学法是一种理想且环保的方法。但是褐藻胶裂解酶的应用目前仍处于研究阶段，无法投入工业大规模生产。

1 褐藻胶裂解酶的来源

迄今为止，许多褐藻胶裂解酶已被鉴定、基因克隆和纯化，其来源多种多样，例如从海带、马尾藻、土壤中分离得到的海洋和陆地细菌、真菌、噬菌体和病毒（小球藻病毒）等，以褐藻为食的海洋软体动物（鲍鱼Haliotis spp.、海兔Aplysia kurodai、短滨螺Littorina brevicula等）的肠道中也存在着褐藻胶裂解酶。特别地，Stender等[6]从人肠道细菌—溶胞拟杆菌中分离得到褐藻胶裂解酶BeclPL6。

目前对细菌产的褐藻胶裂解酶的研究较为广泛和深入，已鉴定出50000多个褐藻胶裂解酶氨基酸序列，其中47000个属于细菌基因组，包括弧菌属Vibriosp.[7-8]、吞噬性去氟弧菌Defluviitalea phaphyphila[9]、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonassp.[10]、铜绿假单胞菌属Pseudomonas aeruginosa[11]、卡拉胶假单胞菌属Pseudoalteromonas carrageenovora[12]、芽孢杆菌属Paenibacillus[13]、溶胞拟杆菌Bacteroides cellulosilyticus[6]、微鳞球菌Microbulbifersp.[14-16]、志贺氏菌Shewanellasp.[17]、嗜盐白蚁菌Zsoptericola halotoleransWX[18]等。

2 褐藻胶裂解酶的作用方式

褐藻胶裂解酶通过β-消除的酸碱催化作用，以1,4O-糖苷键为目标，将褐藻胶降解为带有不饱和双键的寡糖，并在非还原末端形成不饱和残基，用符号Δ表示[19]。褐藻胶裂解酶的β-消除作用如图1所示。

图1 褐藻胶裂解酶的β-消除

Gacesa[20]提出了一种褐藻胶裂解酶的新的催化假说，描述了β-消除反应的三个步骤：（1）去除羧酸盐阴离子上的负电荷，通过盐桥（组氨酸和赖氨酸）中和电荷，降低H-5质子的pKa；（2）一般碱催化提取C-5上的质子，其中可能需要一个残基作为质子提取者，另一个作为质子供体或残基同时充当质子供体和受体，得到稀酸盐中间体；（3）羧基的电子转移导致C-4和C-5之间形成双键，并最终裂解O-糖苷键。

3 褐藻胶裂解酶的分类

3.1 根据分子量大小

根据分子质量，将褐藻胶裂解酶分为三类：第一类分子质量在20～35 kDa之间[13-14]；第二类分子质量约为40 kDa[21-22]；第三类分子质量约为60 kDa[10]。特别地，ZH0-Ⅰ分子质量为91 kDa，ZH0-Ⅳ分子质量为113 kDa[10]。

3.2 根据底物特异性

将褐藻胶裂解酶分为1,4-β-D-聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3），1,4-α-L-聚古罗糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11），以及在两者中均显示活性的双功能酶。目前已报道多种双功能裂解酶，Tavafi等[11]在铜绿假单胞菌中发现了既能降解Poly M，又能降解Poly G的双功能褐藻胶裂解酶。

3.3 根据作用方式

褐藻胶裂解酶可被分为内切酶和外切酶，外切酶也可称为寡褐藻胶裂解酶（EC 4.2.2.26）。迄今为止大部分褐藻胶裂解酶为内切酶，主要产物为不饱和寡糖（2-4糖）。不饱和寡糖无法直接转化为生物燃料，而外切褐藻胶裂解酶作用于褐藻胶或褐藻寡糖的非还原末端，释放出的不饱和残基DEH，可用作生物燃料[5]，生物燃料的生产突出了外切型褐藻胶裂解酶的意义。表1是近年发现的外切褐藻胶裂解酶。

表1 外切褐藻胶裂解酶

3.4 根据序列相似性

根据CAZy数据库（www.CAZy.org/olysaccharide-Lyases.html），褐藻胶裂解酶分为12个多糖裂解酶家族（PLs），包括PL5，PL6，PL7，PL14，PL15，PL17，PL18，PL31，PL32，PL34，PL36和PL39。Helbert等[29]研究表明，PL32，PL34和PL36是新建立的，PL36包括39个细菌序列和一个真菌序列[30]。Ji等[9]从Defluviitalea phaphyphilaAlg1中分离出新的PL39家族的褐藻胶裂解酶。

大多褐藻胶裂解酶属于PL-5和PL-7家族，且多为Poly M裂解酶。但PL-7家族中也包含一部分Poly G裂解酶，对于重组酶Aly1281[12]，Poly G的裂解优于Poly M。近年来PL-6家族的褐藻胶裂解酶也被广泛分离出来。PL-6家族中多为Poly G裂解酶，例如Lyu等[8]从弧菌OU02中分离出的第一个单域结构的褐藻胶裂解酶AlyF是Poly G裂解酶。但也有例外，如SHA-4是PL6家族中第一个对PolyMG有底物偏好性的外切型褐藻胶裂解酶[26]，BeclPL6[6]为Poly M褐藻胶裂解酶。

3.5 根据折叠类型

褐藻胶裂解酶可分为3个折叠类型：β-jelly roll class（PL7，PL14，PL18和PL36）、（α/α）n环折叠（PL5，PL15和PL17）和β-螺旋（PL6）[31]。AlgNJU-03[7]及Aly36B[30]分别属于PL-7和PL-36家族，结构均为β-jelly roll。PL6家族的PsAly[13]及BeclPL6[6]均为β-螺旋结构。

4 褐藻胶裂解酶的酶活测定方法

4.1 初筛——平板测定法

以褐藻胶为唯一碳源，对褐藻胶裂解酶进行定性筛选，包括乙醇法、碘液法、CaCl2法、十六烷基氯化吡啶（CPC）等，未被水解的底物会被染色或形成白色沉淀。

Sawant等[32]首次提出用革兰氏碘代替CPC：革兰氏碘2～3 min即可清楚形成对比区域，而CPC法至少需要30～40 min，且培养基中的琼脂会干扰CPC的作用。因此革兰氏碘是目前使用平板筛选褐藻胶裂解酶产生菌的最佳方法。

4.2 复筛

复筛即定量测定，包括紫外吸光光度法[33]、硫代巴比妥酸法（TBA法）[24]、3,5-二硝基水杨酸法（DNS定糖法）、黏度法等。魏丹等[18]提出了改良版的DNS法，采用0.1 mL酶与1 mL底物反应，沸水灭活3 min，该方法可以减少发酵液中原本的还原糖对显色的影响。近年来紫外法及DNS法应用较为广泛，但因试验条件的不确定性以及酶活单位定义的不同，各种测定方法之间还无法完全进行比较。

5 菌株产酶酶活的提高

对发酵条件的优化可以提高菌株产酶酶活。例如菌株大多需要褐藻胶诱导产酶；海洋细菌对NaCl含量要求较高，且大多褐藻胶裂解酶对Na+具有依赖性；另外金属离子对酶与底物结合时的电荷有影响，使得部分金属离子对酶活具有促进或抑制作用[18]。

由于部分野生菌的不稳定性以及酶活较低，对其进行编码重组可以获得更高酶活的褐藻胶裂解酶。Hu等[33]将Aly7B重组为Aly7B-CDⅠ和Aly7B-CDⅡ，仅Aly7B-CDⅡ具有褐藻胶裂解酶的酶活，且酶活提高了近6倍。Li等[22]将重组褐藻胶裂解酶AlyPL6固定在MTOP上，可以提高其热稳定性和重复利用性，使其在工业上得到更充分的应用。因此，在编码重组及固定化的基础上进行发酵条件的优化，可以得到更高酶活及优良生物活性的褐藻胶裂解酶。

6 褐藻胶裂解酶的酶学性质

不同的褐藻胶裂解酶的酶学性质不尽相同，对酶学性质的研究可以使酶发挥出最大潜力。

研究表明褐藻胶裂解酶最适温度范围为30～50℃，但也有例外，高杨等[21]从印度尼西亚的热泉样品中分离出的褐藻胶裂解酶AlyB5的最适温度为65 ℃，在70 ℃时仍保持75%以上的酶活；而Itoh等[13]克隆出的褐藻胶裂解酶PsAly的最适温度在67 ℃，在37 ℃保存24 h，酶活仍保留50%以上，随着温度升高，其半衰期的出现时间越短。

褐藻胶裂解酶的最适pH约为6.0-8.0，特别的，Li等[22]克隆出的AlyPL6的最适pH为10；严芬等[34]筛选的褐藻胶裂解酶的最适pH为5.5，偏酸性。

不同金属离子会对褐藻胶裂解酶的活性产生影响，少数几个在多金属离子条件下表现出高活性，还有部分受到某些金属离子的抑制作用。He等[10]在鞘氨醇单胞菌中分离克隆了3个内切酶及一个外切酶，Hg2+对这四种酶的活性均有促进作用，同时也存在其他金属离子对克隆出的4个酶有促进或抑制作用。AlgNJU-03的酶活在含有Ca2+、Fe2+或Co2+环境中提高，特别是Ca2+对其酶活促进作用最为明显[7]。Ca2+对较多的褐藻胶裂解酶的酶活具有促进作用，但也有例外，比如AlyF具有钙不依赖性[8]，Ca2+对Aly17B具有抑制作用[35]等。

Zhu等[14]从Microbulbifersp.ALW1中分离出的褐藻胶裂解酶在0.5 mol/L Na+作用下酶活提高5.1倍。重组酶Aly1281[12]具有明显的耐盐性，使其可以应用于褐藻的工业酶法加工而无需进行水密集的脱盐处理。

7 褐藻胶裂解酶的应用

褐藻胶裂解酶可应用于食品、农业、制药及能源等方面，其不仅可以降解褐藻胶，定向制备褐藻寡糖，也可用于阐明褐藻胶的细微结构、制备海藻原生质体、发酵生产乙醇、降解生物膜等。

7.1 功能性低聚糖的制备

褐藻胶内切酶是将褐藻胶生产为功能性低聚糖（2-5糖）的关键工具，不同聚合度的褐藻寡糖的应用也不尽相同。低分子质量（500～3000 Da）和较高的M/G比（＞1）的褐藻寡糖能更好地促进植物的生长[2]。Zhang等[3]和Zhu等[14]发现的褐藻胶裂解酶产的二糖均具有抗氧化活性。Chen等[4]分离出4个不同聚合度（DPs）的寡糖，但在这些寡糖中仅五糖对骨肉瘤细胞显示抗肿瘤功能。

7.2 褐藻胶精细结构的阐明及海藻原生质体制备

褐藻胶裂解酶也可用于分析或修饰褐藻胶的精细结构。Aarstad等[1]采用H-1 NMR，HPAEC-PAD和SEC-MALLS等方法分析降解的反应产物和分离的褐藻胶片段，实现褐藻胶的测序。褐藻胶裂解酶也可以制备藻类的原生质体，应用于基因工程和获得再生植株。Inoue等[36]发现褐藻胶裂解酶可以分解凝胶结构，进而有效地从日本粳稻叶片中分离出原生质体。

7.3 发酵生产乙醇

褐藻胶作为生产生物乙醇的可再生资源，已引起越来越多的关注。褐藻胶、甘露醇和葡萄糖的分解代谢产生了丙酮酸盐，可以从中合成大量的燃料，Wargacki等[5]建立了生产乙醇的微生物平台，其产量可以达到理论值的80%。目前仅在实验室条件下采用工程菌株生产乙醇，还无法完全应用于工业生产。

7.4 生物膜的降解及囊性纤维化的治疗

褐藻胶裂解酶能够降解细菌分泌的褐藻胶形成的生物被膜，增强抗生素的渗透性。部分抗生素（妥布霉素、头孢克肟）与褐藻胶裂解酶具有协同作用，可以促进生物膜的根除，相反也有的抗生素（环丙沙星）与褐藻胶裂解酶的结合显示拮抗作用[11]。褐藻胶裂解酶在囊性纤维化的治疗中也显示出巨大的潜力，Wan等[37]创建了银纳米复合材料，递送两种药物化合物（褐藻胶裂解酶和头孢他啶）以降解褐藻胶并从肺部根除铜绿假单胞菌。

8 结语

目前已经分离并鉴定了各种来源的褐藻胶裂解酶，这些酶具有不同的结构、作用方式和底物特异性，其酶学性质也是多种多样的，可应用于食品、农业、医药和能源等领域。

虽然目前关于褐藻胶裂解酶的研究有很大进展，但仍有许多工作要做。目前发现的褐藻胶裂解酶的稳定性较低，使其仅处于实验室水平，很少应用于工业中，因此分离出活性高和稳定性好的新型酶对于褐藻胶裂解酶的研究和工业发展都具有重要意义。