槟榔雄花蕾中多酚的提取及活性

薛莉君，杨沛，胡浪涛，陈敏

1.重庆化工职业学院（重庆 401120）；2.遵义医科大学第五附属（珠海）医院（珠海 519100）

槟榔主要分布在中国海南、中国台湾、越南、马来西亚等亚热带气候性地区，在中国被誉为四大南药之首[1]。槟榔是一种雌雄同株植物，其雄花蕾中富含生物碱、多酚类物质等多种生理活性物质和微量元素。在医学领域中被证实有利于调节免疫系统、抗炎降脂、利尿除积、抗衰老的功效，因而对人体代谢和生长发育都有所裨益，是食疗和保健佳品[2-3]。槟榔雄花蕾中的多酚类物质主要为没食子酸、香豆酸、儿茶素、绿原酸、阿魏酸和柚皮素，丰富的多酚类物质使得其抗氧化活性较高，清除自由基能力较强。在实际生活中，槟榔雄花蕾除被制作为花茶饮料外，其提取物在化妆品、制药、食品加工中均有所应用[4-5]。试验对槟榔雄花蕾中的多酚类物质进行提取和纯化，并探讨影响多酚类物质抗氧化活性的因素。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

槟榔雄花蕾（台湾共享农业生技股份有限公司）；乙醇（分析纯，重庆宝润化工产品有限公司）；石油醚（工业纯，山东力昂新材料科技有限公司）；DMF（分析纯，广州市三昌化工有限公司）；D301型大孔树脂（武汉市君奇慧科技有限公司）；C18固相萃取柱（北京吉瑞森科技有限责任公司）；没食子酸（工业纯，四川省维克奇生物科技有限公司）。

4MZ-120型粉碎机（郑州驰邦机械设备有限公司）；索式提取器（兰州博辉化玻仪器有限公司）；Scientz-IIDM超声萃取仪[德卡精密量仪（深圳）有限公司]；JQY-C气浴振荡器（上海锦玟仪器设备有限公司）；722N型紫外-可见分光光度计（杭州微米派科技有限公司）；LC-600A高效液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）。

1.2 槟榔雄花蕾的预处理

将雄花蕾表面洗净，用滤纸吸干表面多余水分，剪碎装入保鲜袋中晾晒2 d。取出后加入少量乙醇于粉碎机，粉碎至浆状置于冰箱中备用。

1.3 多酚的提取[6-7]

将备用样品置于索式提取器中，利用石油醚快速过滤2次进行脱脂和除去生物碱。将剩余物质置于超声萃取仪中进行多酚提取，按照料液比1∶20（V/V）加入DMF提取剂，超声提取温度50 ℃，时间20 min，过滤离心得到上清液。上清液经真空浓缩后得到多酚提取液。

取3.0 g大孔树脂于200 mL具塞锥形瓶中，加入一定浓度的多酚提取液，在60 ℃气浴振荡器中振荡吸附。每隔一定时间段取1 mL溶液测定多酚浓度，绘制静态吸附多酚的动力学曲线。

1.4 大孔树脂静态吸附多酚的动力学试验

参考文献[8-9]，采用准二级速率方程t/Qt=1/(KQe2)+t/Qe分析大孔树脂对槟榔多酚的静态吸附动力学。式中，t为吸附时间，h；Qt为大孔树脂在t时刻的多酚吸附量，mg/g；Qe为大孔树脂静态平衡吸附量，mg/g；K为准二级速率方程常数，g/（mg·h）。

1.5 测定方法

1.5.1 HPLC测定

采用C18固相萃取柱，柱温25 ℃，流动相为乙腈溶液。进样量10 μL，流速0.5 mL/min。进样前需用0.22 μm滤膜过滤。

1.5.2 多酚提取量的测定

采用福林酚法[10-11]测定多酚提取量。以没食子酸为标准品配制标准液。添加Folin-Ciocalteau显色剂于不同体积没食子酸标准液中反应，并用Na2CO3溶液定容，离心处理后测定760 nm波长处的吸光度，绘制拟合没食子酸-吸光度标准曲线，得到线性回归方程y=0.1058x+0.0198，R2=0.9937。取1 mL槟榔多酚提取液按上述方法显色后，在760 nm波长处测定吸光度。根据回归方程计算多酚提取量。

1.5.3 DPPH·自由基清除率测定

参照文献[12]，采用吸光度法计算DPPH·清除率。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析

将待测样品在设定条件下进行测定，高效液相分析图谱如图1所示。液相色谱分析的提取液中主要含有8种多酚类物质，这8种物质在图1中标记为a～h，a～h的保留时间分别为7.86，9.18，10.94，13.03，15.13，20.29，21.44和23.93 min。同参考文献[13]中的标准品液相色谱图相比对，这8种物质的分析结果依次应是绿原酸、阿魏酸、山奈素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、柚皮素和香豆酸，与槟榔多酚的主要成分相符。

图1 提取液的HPLC图谱

2.2 不同溶剂提取多酚的效果比较

考察不同溶剂的提取效果，多酚提取量测定结果如表1所示。DMF和氯仿提取效果明显优于乙醚、乙酸乙酯和丙酮。其中，氯仿的提取效果最佳。但由于氯仿不稳定，极易挥发，且沸点相对较低（常压下61℃），不适合后续大孔树脂的加热振荡吸附（60 ℃）纯化操作，故氯仿不适合作为试验中的提取溶剂。DMF常压下沸点为153 ℃，挥发性较氯仿弱，可与水和大多数有机溶剂混溶，因此提取溶剂选用DMF最为适宜。

表1 各溶剂的提取效果

2.3 大孔树脂静态吸附多酚的动力学分析

在pH 5.0、气浴振荡器温度60 ℃、振荡频率80次/min的条件下测定大孔树脂不同时间段内的吸附量。以t为变量，对大孔树脂吸附多酚的t/Qt进行线性拟合，拟合结果如图2所示。拟合线性方程y=0.01406x+0.0007，相关系数R2=0.9987，相关度水平较高，说明大孔树脂对多酚的吸附符合该模型假设。进一步推算出准二级速率常数K=0.2463 g/（mg·h），大孔树脂饱和吸附多酚量为68.37 mg/g，与表2中实际测定的饱和吸附量71.03 mg/g较为接近。

图2 静态吸附动力学方程的拟合曲线

表2 不同时间段下大孔树脂吸附多酚量的测定结果

2.4 多酚抗氧化活性的分析

2.4.1 料液比对多酚DPPH·清除率和还原能力的影响

表3为不同料液比条件下多酚抗氧化能力的比较。料液比1∶5（V/V）时清除DPPH·能力和还原性能力较弱，料液比1∶20（V/V）时最强。随着料液比增大，DPPH·清除率和吸光度均呈现先快速增大后缓慢下降趋势。适合的料液比在能够增大多酚提取量的同时，既不影响其表观活性，又不会降低其在溶液体系中的相对浓度。故试验确定料液比1∶20（V/V）时提取效果最佳。

表3 不同料液比条件下DPPH·清除率和吸光度的测定结果

2.4.2 提取温度对多酚DPPH·清除率和还原能力的影响

由图3可知，提取温度在40～50 ℃范围内，DPPH·清除率和吸光度呈上升趋势，上升速率较为缓慢，在50～65 ℃范围内，DPPH·清除率和吸光度呈下降趋势，且下降速率较大。这是因为在40～50 ℃范围内，多酚类物质的溶出能力逐渐增强，多酚提取量缓慢增大，清除DPPH·自由基能力和还原能力缓慢提升。提取温度50～65 ℃时，多酚的活性开始受到抑制，甚至部分低沸点多酚类物质发生分解，此时虽然温度的提升有助于多酚溶出量的增大，但却极为不利于多酚活性的表现，从图4中可观察到DPPH·清除率和吸光度的下降速率较大。故试验确定提取温度为50 ℃。

图3 提取温度对多酚活性的影响曲线

2.4.3 超声提取时间对多酚DPPH·清除率和还原能力的影响

由图4可知，DPPH·清除率和吸光度均随时间延长呈现先增大后趋于平缓趋势。提取时间在10～20 min内，多酚提取量随时间延长而增大，DPPH·清除率和吸光度会显著提高，提取时间超过20 min后，雄花蕾中的多酚基本被全部提取出并进入溶液体系，继续延长超声提取时间只会增大如小分子多肽、糖类、微量元素等的渗出，多酚的提取量会有所下降。同时，后续大孔树脂吸附的杂质也会增多，从而影响多酚的纯度。故试验选定超声提取时间为20 min。

图4 提取时间对多酚活性的影响曲线

3 结论

采用超声萃取-大孔树脂纯化工艺对槟榔雄花蕾中的多酚类物质进行提取和纯化，经HPLC分析，多酚类物质的主要组成成分为绿原酸、阿魏酸、山奈素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、柚皮素和香豆酸，与槟榔多酚的主要成分相符。对不同溶剂提取多酚的适用性进行比较，确定选用DMF作为提取溶剂。试验还对大孔树脂静态吸附多酚的动力学进行分析，确定准二级速率方程符合该动力学特性，拟合出线性方程y=0.01406x+0.0007，相关系数R2=0.9987，速率常数K=0.2463 g/（mg·h），推算出的大孔树脂饱和吸附量为68.37 mg/g，与实际测定值71.03 mg/g较为接近，说明动力学分析较为契合试验结果。试验从料液比、提取温度、提取时间3个因素探讨对多酚抗氧化活性在DPPH·清除率和还原能力上的影响效果，经分析，确定料液比1∶20（V/V）、提取温度50 ℃、提取时间20 min时，多酚抗氧化活性表现最佳。