皮质醇对LPS损伤的奶牛子宫内膜上皮细胞修复机制的影响

董俊升，王雅丽，方 丽 ，孙法壮，崔璐莹，王 亨，李建基 *

(1.扬州大学 兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009)

子宫内膜对哺乳动物的生殖起着至关重要的作用，影响生殖周期、着床、妊娠等，且能够抵御病原菌的入侵。子宫内膜上皮细胞是子宫内膜的最外层，直接与外界环境接触，在分娩以后子宫内膜上皮细胞受到破坏，并且在此时几乎所有奶牛的生殖道都会被细菌污染，可导致奶牛子宫炎与子宫内膜炎[1-2]。因此，产后奶牛子宫内膜上皮细胞(BEECs)的快速修复对子宫内膜恢复正常的生理功能有着重要意义。大肠杆菌是引起奶牛子宫内膜炎最常见的致病菌，脂多糖(LPS)是其致病性内毒素的主要成分[3]。已有研究报道，用1 mg/L LPS可制作奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞的炎性损伤模型[1]。

组织的修复涉及炎症消退、血管生成、组织重塑和新组织的形成[4]。上皮细胞、基质细胞、白细胞等产生的生长因子，参与修复过程，主要的生长因子有TGF-β、CTGF和VEGF。TGF-βs调控多种细胞的增殖和分化，促进胚胎发育、伤口愈合及血管生成，并且TGF-β1是CTGF的强效诱导剂[5]。CTGF对子宫内膜的修复有明显的促进作用。在增殖期的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞中的CTGF蛋白表达水平明显升高[6]。VEGF是促进血管生成的调控因子，它可以增加血管的通透性，促进细胞迁移[7]。Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路对细胞的增殖、代谢、生存和侵袭等方面都有调控作用[8-9]。近几年，很多研究已经发现Wnt/β-catenin通路参与子宫内膜上皮细胞的生长修复进程[10]。

皮质醇作为一种内源性糖皮质醇激素，对维持机体的生理活动是必须的。但是，在奶牛围产期期间，由于受到多种应激刺激，如妊娠应激、分娩应激、泌乳应激等，奶牛体内皮质醇浓度会出现较大范围的波动[11-12]。目前，系统分析生理浓度和病理浓度的皮质醇水平对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖作用的研究较少，因此本研究选用不同浓度的皮质醇与LPS共同处理原代奶牛子宫内膜上皮细胞，观察在奶牛子宫内膜上皮细胞发生炎性损伤时皮质醇对Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路以及多种生长因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF基因表达的影响，为深入了解产后奶牛子宫内膜的修复机制提供资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器DMEM/F12培养基、链蛋白酶、LPS(O111：B4)和皮质醇均购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Amresco公司；兔源一抗C-Myc、CyclinD1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin和山羊抗兔二抗均购自CST公司；兔源一抗β-catenin购自Abcam公司；反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司；TRIzol购自北京全式金生物有限公司；荧光定量PCR仪和蛋白电泳系统均购自Bio-Rad公司；化学发光成像分析系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 奶牛子宫内膜上皮细胞培养采集健康的奶牛子宫角并置冰盒中，带回实验室进行以下处理。用碘伏、75%酒精对子宫外表进行消毒，无菌条件下将子宫角切成3～4 cm的小块。用含有500 U/mL青霉素和500 U/mL链霉素的PBS反复冲洗，直至清澈。纵向将子宫角切开，暴露子宫内膜组织，放入0.1%链蛋白酶中，4℃ 消化18 h[13]。消化结束后，刮取子宫内膜上皮细胞，置于PBS中，1 200 r/min离心5 min,弃上清，重复3次后，加入完全培养基，接种到细胞瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。24 h后换新的培养液，进行常规培养、传代。

1.3 荧光定量PCR检测生长因子的基因表达将奶牛子宫内膜上皮细胞接种到6孔板中，待细胞达到80%融合，弃掉培养液。对照组加入基础培养液培养，LPS处理组加入含1 mg/L LPS的基础培养液处理，皮质醇处理组加入分别含5,15,30 μg/L皮质醇与1 mg/L LPS的基础培养液共处理。在3,12,18 h时收集细胞，加入TRIzol试剂，根据试剂盒说明书提取细胞总RNA，吸光度(D260/D280)应在1.8～2.1之间，取900 ng RNA反转录成cDNA，进行荧光定量PCR反应。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 30 s，共40个循环。反应体系：SYBR Green mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，无核酸酶水补至25.0 μL。生长因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF、VEGF及内参β-actin的特异性引物序列见表1。

表1 奶牛子宫内膜上皮细胞目的基因引物序列

1.4 Western blot检测Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路关键蛋白的表达将奶牛子宫内膜上皮细胞接种到细胞培养皿中，待细胞融合后弃掉培养液。对照组加入基础培养液培养，LPS处理组加入含1 mg/L LPS的基础培养液处理，皮质醇处理组加入分别含5,15,30 μg/L的皮质醇与1 mg/L LPS的基础培养液共处理。30 min后收集细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白质量浓度，并将各组蛋白质量浓度调至一致。取20～30 μg蛋白进行电泳，转印到PVDF膜上。PVDF膜于5 %脱脂乳中封闭1 h,放入相应的一抗中，4℃孵育过夜。TBST洗涤PVDF膜，二抗室温孵育1 h。TBST洗涤后ECL发光拍照，并用Image J软件对图像灰度值进行分析。

2 结果

2.1 皮质醇对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF mRNA表达的影响5,15,30 μg/L皮质醇与LPS处理细胞后，荧光定量PCR法检测各生长因子mRNA的相对表达量。如图1所示，与空白组相比，LPS处理细胞后极显著增加了TGF-β1和TGF-β3 mRNA的表达(P<0.01)。与LPS组相比，在3和12 h时，各质量浓度的皮质醇显著降低TGF-β1 mRNA 的表达(P<0.05)，在18 h时，5，15 μg/L皮质醇极显著降低TGF-β1 mRNA的表达(P<0.01)；在3，12，18 h时，各个质量浓度的皮质醇均极显著抑制TGF-β3 mRNA的表达(P<0.01)(图1A，B)。与空白组相比，LPS处理后对VEGF mRNA的表达没有显著影响。与LPS组相比，在12 h时，15 μg/L皮质醇显著增加了VEGF mRNA的表达(P<0.05)，在18 h 时，15，30 μg/L皮质醇均显著增加VEGF mRNA的表达(P<0.05)(图1C)。与空白组相比，LPS处理12 h时，CTGF mRNA表达量显著降低(P<0.01)，但在18 h时，其表达量极显著升高(P<0.01)。与LPS组相比，在18 h时，各个质量浓度皮质醇处理组CTGF mRNA的表达量均极显著降低(P<0.01)(图1D)。

与对照组相比，*示差异显著(P<0.05)，**示差异极显著(P<0.01)；与LPS组相比，#示差异显著(P<0.05)，##示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 皮质醇对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin通路的影响由图2可知，LPS处理奶牛子宫内膜上皮细胞后，与对照组相比，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平显著性升高(P<0.05)，表明LPS处理30 min后可以诱导奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin通路的活化。与LPS组相比，15，30 μg/L皮质醇均显著降低β-catenin的表达水平(P<0.05)，30 μg/L皮质醇显著抑制C-Myc和CyclinD1的表达水平(P<0.05)，提示皮质醇能够抑制由LPS诱导的Wnt/β-catenin通路的活化状态。

图2 皮质醇对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞β-catenin、C-Myc、CyclinD1表达的影响

2.3 皮质醇对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞PI3K/AKT通路的影响如图3所示，LPS处理奶牛子宫内膜上皮细胞后，与对照组相比，PI3K和AKT的磷酸化水平极显著升高(P<0.01)，可见LPS处理30 min后激活了奶牛子宫内膜上皮细胞PI3K/AKT通路。与LPS组相比，30 μg/L皮质醇显著降低了AKT的磷酸化水平(P<0.05)。15，30 μg/L 皮质醇均显著降低PI3K的磷酸化水平(P<0.05)。由此可见，皮质醇能够抑制LPS诱导的PI3K/AKT通路的活化。

图3 皮质醇对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞PI3K和AKT磷酸化水平的影响

3 讨论

分娩后，奶牛子宫内膜上皮细胞受到破坏，子宫内膜的快速修复对今后正常的妊娠具有关键作用。并且，子宫内膜上皮细胞在抵御外界病原微生物的入侵中起到天然屏障的作用。皮质醇参与多种生理功能的调控，例如生长增殖、免疫反应、机体代谢等。本试验结果表明，皮质醇能够降低LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞TGF-β1、TGF-β3和CTGF的基因表达，抑制LPS引起的Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化。

伤口愈合是一种高度有序和相互协调的进程，涉及到炎症、细胞增殖、基质沉积和组织重塑。参与子宫内膜修复的生长因子主要有TGF-βs、VEGF和CTGF。研究表明，哺乳动物的TGF-β1和TGF-β3有64%～85%的氨基酸序列是一致的，大部分功能是相似的，但是也有一些区别，TGF-β1诱导皮肤组织的瘢痕化，TGF-β3可抑制这种效果[14]。CTGF是一种多功能生长因子，在多种细胞中都有表达，如在上皮细胞和分泌细胞有表达。在创伤修复期间，CTGF的表达量明显升高，促进伤口愈合、结缔组织细胞增殖及细胞黏附[5]。本试验结果表明，LPS处理后细胞中TGF-β1和TGF-β3基因表达量均增加，这与之前的一些研究是相似的。邓洋[15]证实LPS能够引起奶牛子宫内膜上皮组织中TGF-β1的表达；GU等[16]证实LPS处理髓核细胞后，其TGF-β蛋白表达水平上升。细胞受到LPS刺激后，NF-κB由细胞质转移至细胞核，诱导促炎因子的释放，这些促炎因子能促进TGFβ信号的活化，导致TGF-β表达升高[17]。但是,糖皮质激素具有良好的抗炎效果，能够抑制NF-κB通路，这也与我们的研究结果是相吻合。皮质醇处理后，能够明显抑制TGF-β1和TGF-β3的表达。据报道，LPS能够直接引起肝星状细胞增殖、迁移和细胞因子的产量[18-19]。CTGF在LPS处理前期呈下降趋势，在18 h时出现升高趋势，这可能是由于在炎症前期以炎性损伤为主，后期CTGF表达增多，参与组织修复。当皮质醇处理细胞后，CTGF与TGF-β1和TGF-β3出现相似的结果，其基因表达抑制，说明皮质醇能够抑制由LPS诱导引起的增殖反应。新血管的生成对子宫内膜修复是必要的过程。本试验中VEGF基因的表达水平在LPS处理后没有显著变化，但是皮质醇处理后 VEGF基因的表达明显升高。邓洋[15]研究也证实LPS没有导致奶牛子宫内膜VEGF表达量的明显改变。OLLI等[20]报道，在人视网膜色素上皮细胞中VEGF的表达量可能不受炎症的间接调控作用。当然，具体的原因有待进一步探讨研究。

许多研究已经证实，Wnt/β-catenin涉及子宫内膜的修复，在子宫内膜上皮细胞再生时它处于动态的变化[21-22]。静息状态时，多数β-catenin结合在细胞膜表面，其余的β-catenin存在于细胞质中，与破坏复合体(Axin、APC、GSK-3β和CK1α)结合。β-catenin发生泛素化，被降解。一旦Wnt/β-catenin被激活，活化的Dsh抑制β-catenin降解，β-catenin在细胞质中聚集并进入细胞核，参与基因的调控。在研究中可以看到，LPS能够促进β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表达，表明LPS激活了该通路。据报道，LPS能够活化Wnt/β-catenin通路，促进细胞增殖[23]。皮质醇处理后，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表达均出现下降趋势，并且在30 μg/L时其抑制效果最强。由此可见，皮质醇能够抑制LPS激活的Wnt/β-catenin通路。β-catenin的磷酸化与PI3K信号通路也存在着关联，抑制PI3K的活性，能导致β-catenin泛素化和降解。

PI3K/AKT信号通路在胞内信号传导中有重要作用，调控细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭、代谢和生存。PI3K是AKT的调控因子，能够活化AKT，随后AKT调控细胞的生长和生存。本试验结果表明，LPS能够促进PI3K和AKT发生磷酸化并激活该通路。但是，皮质醇处理以后能抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，抑制子宫内膜上皮细胞中PI3K/AKT通路的活化。据报道，LPS/TLR4信号传导能触发PI3K/AKT通路，增加细胞外基质产量，促进纤维化[24]。据报道，糖皮质激素能够抑制LPS/TLR4信号，降低炎性反应[25]。由此可见，皮质醇能阻止TLR4与PI3K/AKT之间的信号传导，抑制其活化。

综上所述，皮质醇能够抑制LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化，阻止LPS促进生长因子TGF-β1、TGF-β3和CTGF表达量的上升。这可能会减少由于炎症刺激导致的子宫内膜胶原沉积，避免子宫内膜过度的纤维化，同时，干扰了子宫内膜的修复进程。