1种布鲁菌抗体检测试纸条快速检测方法的建立

吴志强，刘少蓉，白民俊，段晓珮，高 强，黄素文，段跃强*

(1.内蒙古华希生物科技有限公司，内蒙古 呼和浩特 010111；2.北京美联泰科生物技术有限公司，北京 100176)

布鲁菌的主要传统检测技术分别有培养特性的鉴定、生化检验、病原分离鉴定及血清学检测等[1]。近年来，运用于临床检测布鲁菌病的免疫学方法主要有虎红平板凝集试验(RBPT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验(CFT)和试管凝集试验(SAT)等[2]。SAT和RBPT操作方法简单，是我国检测布鲁菌病最通用的方法[3]，但缺点是容易发生交叉凝集反应，导致出现假阳性结果[4]。补体结合试验参与试验的因素多，操作比较复杂，试验耗时较长。ELISA虽然诊断率高，但存在交叉反应、试验干扰因素较多、重复性不好、对试剂成分及其生产品牌的选择性高、难以同时区分多种病菌等缺点[1]。

光滑型布鲁菌脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)抗原能诱导动物机体产生长时间的抗体水平，因此，sLPS抗原是布病抗体检测的优势抗原。目前，市售布鲁菌检测试纸条将布鲁菌可溶性蛋白多糖复合物抗原作为检测线，但是存在的问题是产品灵敏度稍差，漏检概率较大。我们研制的布鲁菌抗体检测试纸条，采用了高度纯化的sLPS抗原作为检测抗原，同时利用间接法将胶体金标记在能与哺乳动物IgG普遍反应的葡萄球菌蛋白A(slaphylococcal protein A,SPA)上[5]，充分发挥了胶体金试纸条敏感性高、可对不同动物进行布鲁菌病检测的特点和优势。

本试剂采用胶体金免疫层析法(GICA)研制了可检测牛、羊光滑型布鲁菌抗体的试纸条[6]，作为当前兽医临床诊断动疫病最简便、快速、敏感特异的免疫学检测技术之一，可广泛应用于兽医临床快速检测和现场诊断[7]，有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 菌种与血清光滑型布鲁菌脂多糖(sLPS)由本实验室培养纯化；布鲁菌病阳性血清标准品，购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌阳性血清(牛源)、大肠杆菌阳性血清(羊源)、都柏林沙门菌阳性血清(牛源)、都柏林沙门菌阳性血清(羊源)、产气荚膜梭菌阳性血清(牛源)、产气荚膜梭菌阳性血清(羊源)、小肠结肠炎耶尔森菌O：9阳性血清(牛源)、小肠结肠炎耶尔森菌O：9阳性血清(羊源)、布鲁菌病阴性血清(牛源)和布鲁菌病阴性血清(羊源)等，均由本实验室制备；粗糙型布鲁菌阳性血清，由北京希牧生物技术有限公司研发中心馈赠。

1.2 主要试剂布鲁菌病试管凝集试验抗原，购自中国兽医药品监察所；市售布鲁菌检测试纸条，购自浙江迪恩生物科技股份有限公司；硝酸纤维膜购自默克公司；氯金酸购自Sigma公司；玻璃纤维、PVC底板购自上海金标生物科技有限公司；SPA购自杭州纽龙生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.3 sLPS的粗提及精纯采用热酚水法粗提。取检验合格的菌液，以8 000×g离心30 min，弃上清，测定菌体质量，按比例加入蒸馏水，加热至66℃，在此温度下加入苯酚溶液(水饱和酚溶液)，持续搅拌15 min，冷却至2～8℃。具体操作参照文献[8]。

1.4 sLPS抗原的检验取10 μL sLPS抗原溶液，经SDS-PAGE后分别进行考马斯亮蓝染色和银染。考马斯亮蓝染色：将电泳后的凝胶取出，置于考马斯亮蓝染色液染色4 h以上，放入脱色液中脱色数次，脱色后取出观察分析；银染：将电泳后的凝胶浸入固定液中，于22℃氧化固定15 min，弃去固定液清洗3次加入银染染色液，弃染色液后将凝胶浸入显影液，最后在10%乙酸溶液中作用1 min终止反应。

1.5 胶体金溶液的制备及鉴定配制1%氯金酸溶液，摇匀后放到电磁炉上加热至沸腾，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液，摇匀，继续加热10 min左右，直至溶液呈透亮的酒红色，冷却至室温，用纯化水恢复至原体积，分装到棕色试剂瓶中，置2～8℃避光保存。

1.6 SPA最佳蛋白标记量的确定将不同蛋白含量的SPA加入装有l mL pH7.0的胶体金溶液的1～9号离心管内，混匀静置，再在上述各管内分别加入0.l mL 10%氯化钠溶液，混匀后静置20 min。观察使胶体金溶液呈橙红色未变的最小SPA 用量即为最低稳定量，最低稳定量的10倍即为最适SPA用量。

1.7 试纸条的制备

1.7.1质控线(C线)和检测线(T线)的划膜 将兔抗SPA多克隆抗体和纯化的sLPS分别作为质控抗原和检测抗原，按照摸索好的浓度稀释后，使用金标划膜仪在NC膜喷印C线、T线。

1.7.2胶体金试纸条的组装及结果判定 将各组分依次粘贴，组装成试纸条，置阴凉干燥处贮存。检测血清样品时，C、T线同时出现条带，表示为布鲁菌抗体阳性；只有C线出现条带，表示为布鲁菌抗体阴性；如果C线无红色条带出现，则该试纸条无效。

1.8 试纸条的检验

1.8.1敏感性试验 用样品稀释液将布鲁菌病阳性血清国家标准品(1 000 IU/mL)进行系列稀释，取100.00，10.00，1.00，0.10,0.01 IU/mL 5个稀释度进行试纸条检测，试纸条的敏感度应为结果呈阳性的血清最高稀释度。

1.8.2重复性试验 取同批次及3批不同批次的试纸条分别对布鲁菌病阴、阳性血清检测，根据检测结果判定试纸条的批内和批间重复性。

1.8.3特异性试验 用同一批次试纸条分别检测11种特异性质控血清，根据试验结果观察其特异性。

1.8.4稳定性试验 取密封后的试纸条分别置于4,30℃的环境下保存1,3,6,9,12,15,18,21,24,27个月，取样进行各项指标的检测，根据检测结果确定试纸条的稳定性。

1.9 比对试验(试纸条与试管凝集试验)用试纸条与试管凝集试验同时检测110份牛血清和羊血清，牛、羊血清样品由本实验室制备、采集和检验。凝集试验中先将待检血清稀释后再加入凝集抗原反应，根据血清凝集程度判定结果。根据试验结果比较二者的符合率。

1.10 临床样品检测用试纸条检测120份临床样品，分别为羊源的布鲁菌病阳性血清、牛源的布鲁菌病阳性血清、羊源的布鲁菌病阴性血清和牛源的布鲁菌病阴性血清，各30份，均由本实验室采集分离、检验。将临床样品设盲，由不参与试验的人员对待检血清进行编号，盲底一式二份密封保存。

2 结果

2.1 sLPS抗原纯度测定纯化的sLPS抗原SDS-PAGE后，经考马斯亮蓝染色检测，无蛋白条带(图1)；银染条带均匀分散，条带的相对分子质量主要集中在40～60 kDa(图2)。

M.Marker；1.脂多糖；2,3.sLPS抗原

M.Marker；1～4.sLPS抗原；5.脂多糖

2.2 胶体金表征分析当1%氯金酸溶液与1%柠檬酸三钠溶液的比例为1∶1.6时，肉眼观察制备的胶体金溶液颜色为橙红色，制备的胶体金最大吸收峰在525 nm处，胶体金粒径大小达到要求(表1)。已知胶体金颗粒直径在20～40 nm范围内最稳定，所以，该产品的研发选用25 nm左右粒径的胶体金颗粒。制备的胶体金透射电镜表征见图3，颗粒呈球形，分散性较好，颗粒大小均一。在自然光照下，胶体金溶液呈酒红色，清澈透亮，室温下放置3个月仍能保持稳定，颜色清澈无沉淀析出。

表1 不同比例胶体金颗粒紫外检测结果 nm

图3 胶体金电镜图

2.3 试纸条的制备按照图4的顺序，依次将试纸条各组分组装在一起，结果按照1.7.2方法判定。

1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维膜：4.吸水纸；5.T线；6.C线；7.PVC板

2.4 胶体金试纸条的鉴定

2.4.1敏感性试验结果 用样品稀释液将布鲁菌病阳性血清标准品(1 000 IU/mL)进行系列稀释，取100.00,10.00,1.00，0.10,0.01 IU/mL 5个稀释度进行试纸条检测，结果显示试纸条最低可检测至0.1 IU/mL的布鲁菌病阳性血清，所以试纸条的灵敏度为0.1 IU/mL(图5)，远高于虎红平板凝集试验(25 IU/mL)和试管凝集试验(2.5 IU/mL)的最低检出量。和市场上经批准销售的同类试纸条相比，检测灵敏性提高了100倍，表明我们的试纸条具有高灵敏性。

1.100.00 IU/mL；2.10.00 IU/mL；3.1.00 IU/mL；4.0.10 IU/mL；5.0.01 IU/mL

2.4.2重复性试验结果 用同一批试纸条检测4份阳性血清和4份阴性血清，试验重复3次，结果一致，详细试验结果见图6,7。用3批不同批次试纸条分别检测4份阳性、阴性血清，结果均一致,表明研制的试纸条批内和批间的可重复性均为100%。

1,2.布鲁菌阳性血清(羊源)；3,4.布鲁菌阳性血清(牛源)

2.4.3特异性试验结果 用胶体金试纸条检测11种特异性血清，布鲁菌阳性血清和阴性血清作对照。结果显示，在对照组均成立的条件下，其他11种特异性血清检测结果均为阴性，表明试纸条具有较好的特异性，不与其他非相关疾病感染血清反应(图8)。

1,2.布鲁菌阴性血清(羊源)；3,4.布鲁菌阴性血清(牛源)

1.大肠杆菌阳性血清(牛源)；2.大肠杆菌阳性血清(羊源)；3.都柏林沙门菌阳性血清(牛源)；4.都柏林沙门菌阳性血清(羊源)；5.粗糙型布鲁菌阳性血清；6.产气荚膜梭菌阳性血清(牛源)；7.产气荚膜梭菌阳性血清(羊源)；8.小肠结肠炎耶尔森菌O：9阳性血清(牛源)；9.小肠结肠炎耶尔森菌O：9阳性血清(羊源)；10.布鲁菌病阴性血清(牛源)；11.布鲁菌病阴性血清(羊源)

2.4.4稳定性试验结果 在4,30℃不同环境温度下储存的试纸条，用同一批血清样品进行检测，试验结果显示直到第27个月，试纸条各项性能指标合格，仍可对检测结果进行判定。

2.5 比对试验(试纸条与试管凝集试验)两者对牛血清检测，阳性符合率为100%，阴性符合率为 95.2%，总符合率为95.4%(表2)；对羊血清检测，阳性符合率为97.9%，阴性符合率为93.3%，总符合率为97.2%(表3)。由此可见试纸条检出效率符合诊断试剂的国家标准(标准号：GB/T 26124-2011)。

表2 牛血清样品检测结果符合率

表3 羊血清样品检测结果符合率

2.6 临床样品检测揭盲对120份临床盲样进行检测并揭盲，60份样品为阳性，60份样品为阴性，检测结果均与盲底一致，表明试纸条对于实际检测临床样品具有很强的应用性和准确性。

3 讨论

布鲁菌病(简称布病)近几年在世界范围内广泛流行，特别是在发展中国家暴发更为严重，也对人的健康造成极大的威胁。为此,我国紧急发布了《关于加强布鲁菌防治工作的通知》[9]。通过对血清抗体的监测发现，当病情反复发作时，机体的IgG 抗体可以迅速回升[10]。

我国动物布鲁菌病诊断技术国家标准[11](GB/T 18646-2002)介绍的布病血清学检测方法中，虎红平板凝集试验结果判定主观性强，主观差异性较大；乳牛全乳环状试验仅适用于奶牛，且试验的操作复杂[12]。上述各种试验技术各有其自身的特点，但存在的共同缺陷是以上各种检验都需要在实验室完成，难以在基层中推广使用，而免疫胶体金技术克服了上述缺陷。胶体金试纸条凭借其使用方便、现场迅速判定结果等优势，在动物疫病检测中已得到较广泛的应用[13]。

本试验即采用了高度纯化的 sLPS 抗原作为检测抗原，成功制备了布鲁抗体检测试纸条(胶体金法)。敏感性试验结果表明，我们的试纸条具有高灵敏性；重复性试验用3个不同批次试纸条分别检测4份阳性血清和4份阴性血清，检测结果与试管凝集试验结果均一致，表明研制的试纸条批内和批间可重复性均为100%，具有较好的稳定性；特异性试验在保证对照组成立的条件下，检测11份特异性血清样品为阴性，证明试纸条特异性强，和有可能存在交叉的血清均没有交叉现象，避免像传统检测方法易出现假阳性现象。

根据国家标准《动物布鲁菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)中将试管凝集试验方法确定为标准方法，本试纸条与试管凝集试验进行比对，2者对牛、羊血清的检测的符合率分别为95.4%和97.2%，由此可见试纸条检出效率符合诊断试剂的国家标准，可以保证检测的准确性。常规检测方法耗时较长，本试纸条检测样品时仅需1～2 min即可判读结果，不需要特殊仪器设备，不需要专业操作人员，具有敏感、特异、简便、快速的特点。稳定性试验证明本试纸条在4～30℃条件下可保存长达24个月，更加适合在基层农村和小规模养殖场推广使用。本产品为多种疾病联检试纸条的研制和多标本快速定量检测方法的建立奠定了基础[14]。

本研究成功研制了布鲁菌抗体检测试纸条，它具有很高的灵敏性、特异性、重复性，这一研究结果为基层进行快速动物疾病检测提供了基础。