COPD患者支气管黏膜活检标本中TGF-β、AQP1、HO-1表达及其与肺功能的相关性研究

王建峰，刘宁宁，杨楠楠

（焦作市第二人民医院，河南 焦作 454000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种具有较高发病率、死亡率的呼吸系统慢性疾病,主要表现为肺功能进行减退,严重者可发展为肺源性心脏病、呼吸衰竭等，严重威胁人类身体健康[1]。COPD病情呈进行性进展，病因尚未完全明确，缺乏特效疗法，防重于治疗，故而有必要对COPD患者体内病理变化、临床表现等方面进行研究。转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一种重要的生长因子家族,其在气道重塑方面发挥着重要作用[2]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一类高度保守的跨细胞膜选择性水转运通道蛋白，其中AQP1不仅在瘤体运输中起重要作用,也参与细胞的增殖、迁移及调亡等过程[3]。血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1）是一种催化血红素生成胆红素、CO、铁的限速酶，主要是在机体处于非正常状态或应急状态下发挥作用，既往研究指出，COPD患者体内HO-1活性明显上升，加重低氧血症[4]。目前，有关在COPD患者体内TGF-β水平相关研究主要通过采集血液、手术切除标本进行[5]，HO-1、AQP1水平相关研究多为基础研究[6]，而通过支气管粘膜活检进行研究的报道鲜少。因此，本研究通过纤维支气管镜（fiberoptic bronchoscopy，FB）检查钳取COPD患者支气管粘膜标本，检测标本中TGF-β、AQP1、HO-1表达水平，并分析探讨它们与患者肺功能相关性以及各指标联合检测诊断COPD的效能，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月-2019年6月行纤维支气管镜检查患者76例。纳入标准：胸部X线片或CT检查发现不明原因的肺不张、肺部占位性病变或咯血；患者知情同意参与本研究。排出标准：合并神经系统疾病者；无法耐受FB者；合并除COPD以外其他慢性气道疾病者；恶性肿瘤者。根据COPD诊断标准[7]分为COPD患者45例（COPD组，其中轻度18例，中度27例）与无其他慢性气管炎症性疾病的患者31例（非COPD组）。

1.2 肺功能检查 患者休息5～10min，使用肺功能检测仪进行肺功能检查，主要检测用第1s用力呼气容积 （forced expiratory volume in one second，FEV1）/力呼气肺合量（forced vital capacity，FVC），即为FEV1/FVC，FEV1占预计值百分比（FEV1%）。

1.3 纤维支气管镜检查及支气管黏膜标本收集术前禁食6～8h，术前15min采用雾化吸入2%利多卡因进行咽喉部麻醉。患者取仰卧位，鼻塞吸氧，心电及血氧监护，纤维支气管镜经患者鼻腔进入气道，使用活检钳取肺占位病变的对侧肺上／下叶(中间)、中／下叶支气管间脊黏膜。取出的活检组织即刻置于多聚甲醛中固定、使用梯度酒精脱水，待透明后石蜡包埋，做2μm厚切片以备检测。

1.4 免疫组化学检测 采用链菌素-亲生物素过氧化物酶法（streptavidin-perosidase，SP法），SP试剂盒购自于艾迪生物科技有限公司，特异抗体分别为兔抗人TGF-β、AQP1、HO-1多克隆抗体（分别购自于上海亿欣生物科技有限公司、上海万疆生物技术有限公司、武汉爱博泰克生物科技有限公司）。染色步骤：⑴石蜡切片脱蜡与水化：将石蜡切片置于60℃恒温箱内烘烤20min；石蜡切片置于二甲苯液体中浸泡10min，更换二甲苯再泡10min，然后用无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇各浸泡5min；⑵抗原修复：热修复抗原，切片浸入的0.01mmol/L枸橼酸钠缓冲液（其PH值为6.0），使用微波炉加热至沸腾后断电，等待5～10min，再次重复加热1～2次。置于凉水中至冷却。⑶SP法：冷去后使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，每次5min；置于PBS配置新鲜3%过氧化氢液，室温封闭10min，再用PBS洗3次；滴加10%山羊血清室温封闭15min，接着滴加一抗，4℃环境下过夜，PBS洗3次，每次2min；滴加二抗，20-37℃孵育30分钟，PBS洗3次，每次2min；根据用量，将SP按1:100稀释于PBS中制成工作液，滴加SP工作液，20～37℃孵育30分钟，PBS洗4次，每次5min；DAB显色，根据用量，自配显色液，滴加至切片上，镜下控制反应时间，5～30min，蒸馏水洗终止反应；苏木素轻度复染，脱水、透明、树胶封片，显微镜观察。采用图像分析仪对支气管黏膜TGF-β、AQP1、HO-1阳性细胞数进行半定量检测，测定三者的平均吸光度值，随机测4个高倍视野，计算平均值。

1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0软件，对性别、吸烟情况等计数数据以百分比(%)形式表示，比较用χ2检 验；对 年 龄 构 成、吸 烟 数 量、FEV1/FVC、FEV1%、吸光度值等计量数据以均数±标准差()形式表示，比较用独立t检验；TGF-β、AQP1、HO-1表达与FEV1/FVC、FEV1%的相关性用Pearson分析，用受试者工作特征曲线（ROC）评估诊断效能，P<0.05，表示对比差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基线资料对比 两组在性别、年龄构成、吸烟情况方面对比,差异无统计学意义(P>0.05);COPD组患者FEV1/FVC、FEV1%均明显低于非COPD组（P<0.05）。见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比COPD组患者支气管黏膜中TGF-β、HO-1表达水平明显高于非COPD组（P<0.05），而AQP1表达水平明显低于非COPD组（P<0.05）。见表2。

表2 两组患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比（s）

表2 两组患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比（s）

组别 n COPD组非COPD组t值P值45 31--TGF-β AQP1 1.07±0.25 0.76±0.14 6.253＜0.001 0.21±0.08 0.52±0.19 9.523＜0.001 HO-1 0.15±0.04 0.10±0.03 5.740＜0.001

2.3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比 轻度COPD组患者支气管黏膜中TGF-β、HO-1表达水平明显低于中度COPD组（P<0.05），而AQP1表达水平明显高于中度COPD组（P<0.05）。见表3。

表3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比（）

表3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表达水平对比（）

组别 n轻度COPD组中度COPD组t值P值18 27--TGF-β AQP1 0.85±0.18 1.22±0.33 4.336＜0.001 0.29±0.13 0.15±0.05 5.083＜0.001 HO-1 0.13±0.03 0.17±0.05 3.042 0.003

2.4 TGF-β、AQP1、HO-1表达水平与FEV1/FVC、FEV1%的相关性分析COPD组患者支气管黏膜中TGF-β、HO-1表达水平与FEV1/FVC、FEV1%均呈明显负相关(P<0.05)，AQP1表达水平与FEV1/FVC、FEV1%呈明显正相关(P<0.05)。见表4。

表4 TGF-β、AQP1、HO-1表达水平与FEV1/FVC、FEV1%的相关性分析

2.5 TGF-β、AQP1、HO-1对COPD的 诊 断 价 值当TGF-β表达水平取最佳截断值1.01，AQP1表达水平取最佳截断值0.32，HO-1表达水平取最佳截断值0.11时，上述指标联合诊断COPD的AUC高于各指标单一检测。见图1，表5。

表5 TGF-β、AQP1、HO-1对COPD的诊断价值

图1 TGF-β、AQP1、HO-1诊断COPD的ROC曲线

3 讨论

一项Meta分析显示，我国≥40岁人群COPD的发病率为9.9%，男性患病率高于女性，且随着年龄的增长，发病率逐渐上升[8]。肺功能检查是呼吸系统疾病必要的检查项目,其可有效判别患者肺功能是否正常。本研究结果显示,COPD组患者FEV1/FVC、FEV1%明显低于非COPD组,提示COPD患者肺功能明显降低，肺部损伤加重，与国内学者研究结果一致[9]。但影响COPD的因素较多，其发病机制尚未完全明确，主要可能与炎症反应、氧化应激以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡有关[10]，患者病情呈进行性进展，临床上缺乏有效的治疗措施，故有必要进行病理方面的研究。

COPD患者的气道炎症可激活单核巨噬细胞，通过自分泌或旁分泌TGF-β进一步刺激巨噬细胞的合成及炎症介质，加重炎症反应；TGF-β是一类具有转化作用的生长因子，其可促使气道平滑肌细胞的增殖、迁移，参与气道重塑，也可促进氧化应激，加重气道炎症[11]。陈娟等[12]研究指出，COPD患者气道组织TGF-β的表达明显上升，参与了气道重塑。本研究中，与非COPD组相比，COPD组患者支气管黏膜中TGF-β表达水平明显升高，且病情越严重的患者，其TGF-β表达水平越高，提示支气管黏膜中TGF-β表达水平对COPD患者病情严重程度具有指示作用，此与上述学者及既往研究结果均相似[13]。

目前，在人体内发现的AQPs有13种，分布在肺 组 织 的 主 要 为AQP1、3、4、5，其 异 常 表 达 与COPD气道炎症、气道重塑及肺功能下降等密切相关[14]。石志红等[15]研究指出，COPD患者肺组织中AQP5表达水平显著降低,且中度病情患者AQP5表达水平低于轻度患者。AQP1主要表达于起到上皮细胞、支气管黏膜下腺、肺毛细血管内皮中,具有清支气管与血管周围水分的作用[16],但有关AQP1在COPD患者研究鲜少，相关报道多是基础研究。本研究结果显示，COPD组患者支气管黏膜中AQP1表达水平明显低于非COPD组，且中度病情患者AQP1表达水平低于轻度患者，提示AQP1可能参与了COPD的发生发展。这也与COPD患者存在气道炎症，炎症的长期刺激会使气道中杯状细胞及粘液腺的增生与化生，造成气道粘液高分泌，影响其表达有关。因此，AQP1的表达水平可作为判断COPD发生发展的新指标。

HO有3种同工酶，其中HO-1为诱导型抗氧化酶，表达于心、肺、脑等多种组织，可将血红素分解为胆红素、CO及铁,发挥保护细胞免受氧化应激及炎症损伤的作用[17]。李巧荣等[18]研究发现，COPD患者支气管黏膜中HO-1的表达水平升高，并与肺功能有关。本研究结果也发现，HO-1在两组患者支气管黏膜中表达水平同TGF-β，且其水平变化与病情严重程度一致。这可能是因为COPD患者缺氧、炎症反应、氧化应激反应等多种因素可诱导HO-1mRNA的转录，使得HO-1合成增加。香烟烟雾是导致COPD发生的主要危险因素，可诱发细胞氧化应激，Lee等[19]研究了COPD患者支气管上皮细胞中HO-1表达降低的分子机制，研究发现香烟烟雾提取物可通过激活核因子E2相关因子的活性从而增加HO-1水平。

同时本研究也分析了TGF-β、AQP1、HO-1与FEV1/FVC、FEV1%相关性，Pearson相关性结果显示，TGF-β、HO-1与FEV1/FVC呈 明 显 负 相 关，AQP1与FEV1/FVC呈明显正相关；TGF-β、HO-1与FEV1%呈明显负相关，AQP1与FEV1%呈明显正相关；提示TGF-β、AQP1、HO-1的表达水平可反映COPD患者肺功能损伤程度，可作为诊断COPD的标志物。这可能与病情进展，使得炎症程度、氧化应激加重有关。进一步ROC分析结果显示，TGF-β、AQP1、HO-1能够较好地指示COPD诊断，联合检测具有更优的诊断价值。但本研究纳入COPD患者有限，后续尚需扩大样本数量进行深入探讨，以便对临床治疗有更好参考意义。近年，Bafadhel[20]等外国学者也就COPD患者预后不良风险的预测指标展开分析，以探寻COPD病情发生发展的新型监测指标，为临床诊疗提供新方向。AQP1、HO-1此前在与COPD关系的研究中以体外实验为主，而本研究针对COPD患者的表达水平进行探析，发现2种新型监测指标在COPD病情判断中具有可行性，可为国内COPD诊疗提供新方向，且联合监测TGF-β对判断肺功能损伤程度有利。

综上所述，COPD患者支气管黏膜中TGF-β、HO-1表达水平增加，与FEV1/FVC、FEV1%负相关；AQP1表达水平降低，与FEV1/FVC、FEV1%正相关，TGF-β、AQP1、HO-1联合检测对COPD有更佳的诊断价值，可作为COPD诊断的标志物。