高效液相色谱-荧光检测法测定保健食品中的维生素K1 和维生素K2

许强，孟凡达，王轶鹏，张志涛，王玮，王郡甫

(山东省医学科学院 基础医学研究所,山东第一医科大学,济南 250062)

维生素K 又称凝血维生素,包含维生素K1、K2、K3、K4等4种形式,最早于1929年由丹麦化学家达姆从动物肝脏和麻子油中发现。维生素K1、K2均为脂溶性化合物,属于2-甲基-1,4-萘醌衍生物。维生素K1存在于绿色植物中,是食物中维生素K 的主要来源;维生素K2主要由肠道细菌合成。维生素K1、K2主要参与肝脏凝血酶原和其他凝血因子的合成,当体内缺乏时可造成凝血障碍[1-2],可用于预防和治疗肝癌和白血病[3-7]。此外,它们也参与骨代谢和细胞生长,在预防和治疗骨质疏松等方面的效果显著[8-10]。因此,维生素K1和K2被广泛添加于药品和保健食品中,对这些产品中维生素K1和K2含量的测定意义重大。

目前维生素K1、K2的测定方法主要有高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等[11-19]。以上方法各有优缺点,在微痕量组分分析时,HPLC-UV 的选择性和灵敏度相对较差;HPLC-MS灵敏度较高,但仪器昂贵,难以在基层实验室推广,由于目前的检测方法多为单项逐一检测,故建立一种同时测定维生素K1、K2的方法,能够极大地降低试剂消耗、节省检测时间,具有十分重要的应用价值。

在文献[11-19]的基础上,本工作在对保健食品软胶囊样品进行简单的前处理后,采用锌粉还原柱对样品溶液中的维生素K1、K2进行柱后化学衍生,使维生素K 同系物的母核萘醌环产生荧光,进而可被高效液相色谱仪附带的FLD 检测,该方法简单、高效,可为保健品中维生素K1、K2的测定提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配1200型荧光检测器;Ultrasonic Cleaner 1730T 型超声波发生器;锌粉还原柱(50 mm×4.6 mm)。

维生素K1、K2单标准储备溶液:1 000 mg·L－1,分别称取维生素K1、K2标准品10.0 mg,用甲醇溶解并定容于10.0 mL 棕色容量瓶中,摇匀后于4 ℃保存。

维生素K1、K2混合标准溶液系列:取适量维生素K1、K2单标准储备溶液,用甲醇逐级稀释配制成含有5,10,20,50,100μg·L－1维生素K1,20,40,80,200,400μg·L－1维生素K2的混合标准溶液系列,摇匀后于4 ℃保存。配制过程注意避光。

甲醇、四氢呋喃为色谱纯;冰乙酸、氯化锌、无水乙酸钠为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm);柱温35 ℃;流量1.0 mL·min－1;进样量10μL;流动相为含11 mmol·L－1氯化锌,6 mmol·L－1乙酸钠,0.03%(体积分数,下同)乙酸,10%(体积分数,下同)四氢呋喃的90%(体积分数,下同)甲醇溶液;等度洗脱;荧光激发波长243 nm,发射波长430 nm。

1.3 试验方法

称取1.00 g 样品,加入8 mL 异丙醇后,在80 W 功率下超声10 min,静置冷却至室温,用异丙醇定容至10 mL,溶液过0.22μm 滤膜,滤液置于棕色进样瓶中,按仪器工作条件测定。试验过程注意避光。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对维生素K1、K2混合标准溶液和样品溶液进行测定,色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

由图1可知:维生素K1、K2的色谱分离效果较好,且样品溶液中其他杂质不干扰目标物的测定。

2.2 溶解试剂的选择

维生素K1、K2为脂溶性维生素,而相关保健食品多以大豆油为基质,故试验选择以异丙醇、正己烷和甲醇作为溶解试剂,并按照试验方法考察了其对实际样品的溶解效果。结果显示:以甲醇作溶解试剂时,样品溶液会出现分层现象,其他两种溶剂的溶解效果均较好。考虑到正己烷易对反相色谱柱造成损害,故试验选择异丙醇作溶解试剂。

2.3 干扰试验

选择同样以大豆油为基质的含有维生素A、维生素D 和维生素E 的保健食品软胶囊作为干扰试验样本,分别加入维生素K1、K20.1,0.4μg,按照试验方法测定。结果显示:K1和K2测定值相对误差的绝对值不大于5%,说明维生素A、维生素D 和维生素E对维生素K1、K2的测定无影响。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件对维生素K1、K2混合标准溶液系列进行测定,以两者的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:维生素K1的线性范围为5～100μg·L－1,线性回归方程 为y＝8.706x＋0.1114,相关系数为0.999 7;维生素K2的线性范围为20～400μg·L－1,线性回归方程为y＝9.052x＋1.452,相关系数为0.999 8。

以3倍、10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)。结果表明:维生素K1、K2的检出限分别为0.03,0.06μg·L－1,测定下限分别为0.10,0.20μg·L－1。

2.5 精密度与回收试验

按照试验方法对阴性样品进行低、中、高等3种浓度水平的加标回收试验,每个加标水平平行测定6次,计算维生素K1、K2的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知:维生素K1和维生素K2的回收率为95.7%～101%,RSD 为1.8%～4.1%,表明该方法的准确度和精密度良好。

2.6 样品分析

按试验方法分析某企业提供的分别含维生素K1和维生素K2的两种软胶囊类保健食品。结果显示,维生素K1和维生素K2的检出量分别为32.50,39.27μg·g－1,与维生素K1标示量(不小于30μg·g－1)和维生素K2标示量(不小于35μg·g－1)一致。

本工作建立了HPLC-FLD 测定保健食品软胶囊中维生素K1、K2含量的方法,该方法分离效果好、灵敏度高,精密度和准确度均较好,可满足保健食品检测工作的需求。