凯氏蒸馏-自动光度滴定法测定水果干制品中二氧化硫残留量

郑学殷，李秀英*，党华，李瑞玲

(1.广州检验检测认证集团有限公司,国家加工食品质量检验中心(广东),广州 511447;2.SGS通标标准技术服务有限公司广州分公司,广州 510663)

二氧化硫是国内外允许使用的一种食品添加剂,具有护色、防腐、漂白和抗氧化的作用。果蔬原料利用二氧化硫熏蒸后,可以防止在贮藏和加工过程中发生氧化褐变或微生物污染。按照标准规定合理使用二氧化硫不会对人体健康造成危害,但长期超限量接触二氧化硫可能导致人类呼吸系统疾病及多组织损伤[1]。国家市场监督管理总局在其官网中通告了多批二氧化硫超标食品,其中以水果干制品居多[2-4]。文献[5]对27种食品中二氧化硫残留的累积风险进行了评估,发现水果干类食品中的二氧化硫残留量偏高。因此,加强对水果干制品中二氧化硫的检测显得尤为重要。

目前,食品中二氧化硫的检测方法主要为滴定法,该方法能够降低假阳性结果的概率和本身有颜色的样品对检测结果的影响,适用性更广。然而,这种方法存在一些缺点:仪器的气密性和稳定性对结果影响较大;全玻璃蒸馏花费时间较长,且无法实现样品的大批量检测[6];碘量法以目视法判断终点,光线条件和分析人员对颜色的敏感程度均会影响测定结果,且重复性不佳。因此,需要探索出一种高效、灵敏、可自动控制的方法来解决以上问题。

本工作用盐酸溶液超声处理样品,以自动化程度更高的凯氏蒸馏法提取目标物,用自动光度滴定法对二氧化硫含量进行测定,该方法终点检测灵敏度高[7],重现性好,自动化程度高,可为水果干制品中二氧化硫的自动化分析提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

905型自动滴定仪,配6.1115.000型光度电极和Tiamo 2.5操作平台;Vap 200型全自动凯氏蒸馏仪;MS204TS/02型分析天平。

乙酸铅溶液:20 g·L－1。

乙二胺四乙酸二钠盐溶液:0.5 g·mL－1。

碘标准滴定溶液:0.010 10 mol·L－1。

盐酸、乙酸铅、无水亚硫酸钠、可溶性淀粉均为分析纯;试验用水为三级水;芒果干、雪梨干、苹果干等散装水果干制品均采购于市场。

1.2 试验方法

参考GB 5009.34－2016《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》[8]中的全玻璃蒸馏-人工滴定法,称取5 g粉碎后的样品置于蒸馏管中,加入水270 mL和7 mol·L－1盐酸溶液10 mL,在90%蒸汽输出量下超声浸提15 min。将蒸馏管置于凯氏蒸馏仪上,在90%的蒸汽输出量下蒸馏9 min,冷凝管置于装有25 mL吸收液(20 g·L－1乙酸铅溶液)的烧杯中。用少量蒸馏水冲洗与吸收液接触的冷凝管,取下烧杯,依次加入盐酸10 mL、10 g·L－1淀粉指示液1 mL,放入转子,置于自动滴定仪上,滴定管应位于湍流最大的位置,用0.010 10 mol·L－1碘标准溶液在MET(等量滴定)模式下进行滴定,设置搅拌速率为8 r·min－1,检测波长为640 nm,信号漂移值为15 m V·min－1,一阶导数突跃值为3 m V,用Tiamo 2.5操作平台按照公式(1)计算样品中的总二氧化硫量w(以SO2计,g·kg－1)。按照相同方法做样品空白试验。

式中:V为样品消耗的碘标准溶液体积,为m L;V0为样品空白消耗的碘标准溶液体积,m L;m为样品质量,g;c为碘标准溶液的浓度,0.010 10 mol·L－1;0.032 为 与1 mL碘标准溶液[(c(1/2I2)＝1.0 mol·L－1)]相当的二氧化硫的质量,g。

2 结果与讨论

2.1 滴定曲线

自动光度滴定法是利用滴定过程中反应物或生成物在特定波长下颜色的突变引起吸光度变化的原理进行检测,颜色变化会引起电位的突变,以此来确定滴定终点[9],本工作所得的二氧化硫的滴定曲线见图1。

由图1 可知:在滴定剂的体积不大于0.6 mL时,电位基本趋于稳定;当滴定剂的体积为0.85 mL时,电位急剧下降。可用滴定曲线的一阶导数确定等当点(EP1)[10],等当点即为滴定终点。

图1 二氧化硫滴定曲线Fig.1 Titration curve of sulfur dioxide

2.2 基于单因素试验的试验条件的优化

试验考察了水体积(m L)和样品质量(g)比(液料比,x1)分别为30∶1,40∶1,50∶1,60∶1,70∶1(m L∶g),超声浸提时间(t)分别为0,5,10,15,20 min,盐酸溶液浓度(c)分别为2,4,6,8,10 mol·L－1,蒸汽输出量(x2)分别为60%,70%,80%,90%,100%时对水果干制品中二氧化硫测定值的影响,结果见图2。

由图2可知:二氧化硫测定值均随着液料比、超声浸提时间、盐酸溶液浓度和蒸汽输出量的增加先增加后降低,当液料比为50∶1(m L∶g)、超声浸提时间为15 min、盐酸溶液浓度为6 mol·L－1、蒸汽输出量为90%时,所得二氧化硫测定值最大。因此,试验选择的液料比为50∶1(m L∶g)、超声浸提时间为15 min、盐酸溶液浓度为6 mol·L－1、蒸汽输出量为90%。

图2 液料比、超声浸提时间、盐酸溶液浓度和蒸汽输出量对二氧化硫测定的影响Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid,ultrasonic extracting time,concentration of HCl solution and steam output on the determination of SO2

2.3 基于响应面Box-Behnken设计试验的试验条件的优化

2.3.1 响应曲面模型的试验结果

基于单因素试验结果,以芒果干为待测对象,用Design-Expert 11软件中的响应面Box-Behnken设计方案考察了超声浸提时间、盐酸溶液浓度、液料比、蒸汽输出量等4个因素对二氧化硫测定值(Y)的影响,在－1,0,＋1对应的低、中、高等3种编码水平下[11-14],采用4因素3水平建立响应曲面模型,结果见表1。

表1 Box-Behnken设计试验结果Tab.1 Results of test for Box-Behnken design

表1 (续)

采用方差分析(ANOVA)对表1结果进行二次多项式拟合,得到了二次多项回归方程[公式(2)]:

对回归方程进行显著性检验,方差分析结果见表2。其中,P＞0.05,对结果影响不显著;0.01＜P≤0.05,对结果影响显著;P≤0.01,对结果影响极显著。

表2 响应曲面二次回归模型的方差分析结果Tab.2 ANOVA results for quadratic regression model of response surface

P值通常用来检验变量的显著性,也可以反映各自变量之间的交互强度[15]。由表2可知,所建模型的P值小于0.000 1,远小于0.01,可以极显著地表示测定值与各因素之间的关系,该模型具有统计学意义;失拟项的P值为0.107 9,大于0.05,说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小[16];一次项t、c、x1的P值均小于0.01,说明这3个因素对测定值影响极显著,x2的P值为0.013 9,小于0.05,说明蒸汽输出量对测定值的影响显著;交互项tx2、cx1和x1x2的P值均小于0.01,说明这3个交互项对测定值的影响极显著,tc、tx1的P值位于0.01～0.05之间,说明这2个交互项对测定值的影响显著,cx2的P值为0.950 5,大于0.05,说明这个交互项对测定值的影响不显著;二次项t2、c2、x12和x22的P值均小于0.000 1,说明这4个二次项对测定值的影响极显著。各因素对二氧化硫测定值的贡献度,按照从大到小顺序排列,依次为盐酸溶液浓度、液料比、超声浸提时间、蒸汽输出量。

通过方差分析还可得到,模型的复相关系数(r)为0.988 6,校正决定系数为0.977 2,说明测定值中有97.72%的变异来源于盐酸溶液浓度、液料比、超声浸提时间和蒸汽输出量,只有1.14%的变异不能被模型解释,说明该模型拟合度较好;预测决定系数(0.938 9)与接近,变异系数(C.V.)为2.88%,说明试验预测值的拟合度较好,该模型可以很好地反映测定值;信噪比(Adeq Precision)为29.173 1,表明该模型具有较高的可信性。

学生化残差是用于考察测定值相对于回归拟合是否为异常数值[17],残差图的分布可以帮助判明所拟合的回归模型是否满足有关假设,由Box-Behnken设计方案得到图3。其中,颜色由浅入深代表二氧化硫含量由小到大变化。

图3 残差与预测值的数据分布图和残差的正态分布图Fig.3 Data distribution of residual and predicted values and normal distribution plot of residuals

由图3(a)可知:学生化残差与模型预测值的数据的分布是分散无规律的,说明模型是比较理想的;由图3(b)可知,数据沿直线分布,说明残差的分布接近于正态分布,该模型的适用性较好。

对测定值和预测值进行线性回归,由Box-Behnken设计方案得到图4。其中,颜色由浅入深代表二氧化硫含量由小到大变化。

图4 预测值与测定值的线性回归图Fig.4 Linear regression graph of predicted value and measured value

由图4可知:数据靠近直线分布,且大部分的测定值落在预测值上,少部分测定值对称分布在预测值两侧,说明测定值和预测值基本一致,回归模型的拟合度较好。

2.3.2 响应面图结果

响应面分析法是常用的观察自变量对因变量影响的方法,常用二维等高线图和三维响应面图表示,可通过将两个变量固定在中心点,在试验范围内改变另两个变量来实现[18-19],所得三维响应面图和等高线图分别见图5和图6。其中,响应面向上凸起,且曲面坡度越陡峭,说明2个因素交互作用越强;等高线图的圆心是极值所在的区域,等高线为闭合的椭圆形,椭圆越扁,2个因素的交互性越强[20],对测定值的影响越显著。反之,响应面曲面坡度越平滑,等高线呈圆形,说明2个因素交互作用越弱,对测定值影响越小。

由图5～图6可知:按照交互作用的影响程度从大到小的顺序排序,依次为超声浸提时间与蒸汽输出量、盐酸溶液浓度与液料比、液料比与蒸汽输出量、超声浸提时间与盐酸溶液浓度、超声浸提时间与液料比、盐酸溶液浓度与蒸汽输出量,其中,前5种交互作用对二氧化硫测定值的影响较显著,这与方差分析的结果一致。

图5 4因素两两交互下的响应面图Fig.5 Response surface diagrams under the interaction in pairs of 4 factors

图6 4因素两两交互下的等高线图Fig.6 Contour maps under the interaction in pairs of 4 factors

2.3.3 试验条件的确定及验证

利用Design Expert 11.0软件对所得二次多项回归方程进行逐步分析,确定最佳参数组合为液料比53.508∶1(m L∶g)、超声浸提时间15.943min、盐酸溶液浓度6.985mol·L－1,蒸汽输出量90.025%,在此组合下,二氧化硫预测值为0.365 g·kg－1。为了方便操作,将最佳参数组合修改成液料比54∶1(m L∶g)、超声浸提时间15.9 min、盐酸溶液浓度7.0 mol·L－1,蒸汽输出量90%,在此条件下对同一样品重复分析5 次,二氧化硫测定值为0.367 g·kg－1,与模型预测值(0.365 g·kg－1)非常接近,说明响应面模型用于本方法试验条件优化的可靠性较高。

2.4 滴定试验条件的选择

试验环境会通过影响信号漂移值和一阶导数突跃(DMV)值来影响滴定终点的电位和仪器的测量精度。当信号漂移值过高、DMV 值过小时,仪器的抗噪性能降低。加液速率过快时,易出现假终点,测定值偏低,反之滴定终点则会延迟,滴定时间延长,结果偏高。溶液的充分混合在滴定过程中非常重要,可通过搅拌速率来控制。当搅拌速率太大时,溶液会产生气泡,搅拌速率太小时,电极周围的溶液不能很好地混合,速率过大或过小均会造成测定结果的不准确,应选择合适的搅拌速率,使溶液在搅拌过程中形成小漩涡,并使滴定管位于湍流最大的位置。另外,由于光度电极对颜色的变化极为敏感,滴定剂加入的位置应与电极的距离尽量远,并应根据搅拌方向放置电极和滴定头。试验选择的滴定试验条件见1.2节。

2.5 干扰试验

乙酸是水果干制品中的一种常见挥发性有机酸,可能影响二氧化硫的测定。取已知二氧化硫含量的雪梨干和芒果干等两种样品,每种样品中均加入3种不同体积的乙酸,按照试验方法测定,计算相对误差,所得结果见表3。

表3 干扰试验Tab.3 Interference experiment

由表3可知,相对误差的绝对值均不大于5%,说明样品中所含挥发酸乙酸不干扰二氧化硫的测定。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法重复分析柠檬片、榴莲干、香蕉片、番石榴干、苹果干、芒果干和黄桃干等7种样品各7次,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示:测定值分别为0.757,0.296,0.464,0.225,0.313,0.366,0.088 g·kg－1,测定值的RSD 分别为0.68%,0.68%,0.58%,0.42%,0.31%,0.52%,0.86%,符合方法学精密度的要求。

称取0.500 g亚硫酸钠,溶于0.5 g·mL－1乙二胺四乙酸二钠盐溶液500 mL 中,缓慢摇匀,放置2～3 h,按照文献[21]的方法对其含量进行标定,以二氧化硫计,其标定值为394 mg·L－1。在黄桃干、百香果干、荔枝干、雪梨干和芒果干等5种样品中加入亚硫酸钠标准溶液1,2,3,4,5 mL,对应的加标量分别为0.079,0.158,0.236,0.315,0.394 g·kg－1,按照试验方法测定,所得结果见表4。

表4 回收试验结果Tab.4 Results of test for recovery

由表4 可知,二氧化硫的回收率为94.3%～99.7%。

2.7 方法比对

本法用于分析10种样品,并同全玻璃蒸馏器-人工滴定法(国家标准方法)[8]进行比对,结果见表5。

由表5可知,2种方法测定值基本一致,本法的测定值略高于国家标准方法的。可能原因:凯氏蒸馏仪的蒸汽输出量稳定可控,蒸馏效果好于全玻璃蒸馏器;光度电极对颜色的判断更灵敏,可有效避免人肉眼观察指示剂的变色区域时产生的视觉误差[22];该方法对滴定终点的判断是由仪器生成的滴定曲线的一阶导数确定的,等当点与终点的误差非常小。对2种方进行t检验,所得P值为0.25,大于0.05,说明在95%的置信水平下,2种方法没有显著性差异,符合检测要求。

表5 方法比对结果Tab.5 Results of method comparison g·kg－1

本工作分别采用单因素试验和响应面设计试验优化了液料比、超声浸提时间、蒸汽输出量和盐酸溶液浓度等条件,采用凯氏蒸馏-自动光度滴定法测定水果干制品中二氧化硫含量,该方法解决了目前在亚硫酸盐含量测定方法中自动化程度低、蒸馏环境易被污染和滴定终点难判断等问题,全程皆由仪器控制、等当点判断准确、使用方便、测定快速,精密度和准确度均较好,可用于水果干制品中二氧化硫含量的测定。