ACAD9基因新发变异致线粒体复合物I缺乏症20型1例报告并文献复习

崔清洋 曹银利 唐成和 韩 炜 王卫卫 贾倩芳

新乡医学院第一附属医院儿科（河南卫辉 453100）

线粒体疾病是一组遗传和临床异质性疾病，一般有进行性和多系统性受累特征，是人类最常见的遗传性疾病之一，发病率估计为1/5000活产儿。线粒体受核基因组与线粒体基因组的双重遗传调控，其功能是通过氧化磷酸化给正常细胞的功能提供所需的能量。而线粒体内的氧化磷酸化系统包括线粒体呼吸链复合物（复合物Ⅰ～Ⅳ）和腺苷三磷酸酶（复合物Ⅴ），复合物Ⅰ缺陷是线粒体病最常见的生化缺陷，占所有缺陷的1/3[1]，其中线粒体基因编码13个亚基，而核基因编码约70余个亚基，涉及线粒体DNA的复制、转录、翻译以及酶复合体的组装、物质代谢及线粒体融合相关的1 000余种的编码产物。

人类的线粒体疾病约40%在新生儿期发病，其中25%为母系遗传，大部分为常染色体隐性遗传，时有散发、X 连锁和常染色体显性遗传。有报道核基因变异所致的线粒体疾病占到75%～95%[2]，而核基因的变异可分为10 种类型[3]，其一类型即为呼吸链复合物亚基及组装因子的变异，而涉及复合物Ⅰ变异的基因包括NDUFS 1-8、NDUFV 1-2、NDUFA 1-2、NDUFA 9-12、NDUFB 3、NDUFAF 1-6、FOXRED 1、NUBPL及ACAD9。

线粒体复合物Ⅰ缺乏症常见的临床表型有Leigh综合征、Leigh样综合征、Leber遗传性视神经病、线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作、新生儿心肌病、严重新生儿乳酸酸中毒、白质脑病、非特异性脑病等，其中的Leigh综合征和Leigh样综合征最为常见，占到单纯性线粒体复合物Ⅰ缺乏症的50%以上。

目前累及核基因ACAD9变异的线粒体复合物Ⅰ缺乏症20型（mitochondrial complexⅠdeficiency type 20，MC 1 DN 20）国内外报道很少，仅为个案或小的队列研究，且部分资料不详，目前国内尚无新生儿病例报道。本文回顾分析1例MC1DN20新生儿的临床资料，其ACAD 9基因的c.1278+1 G>A剪切变异和c.895A>T错义变异均为国际上首次报道。

1 临床资料

患儿，男，胎龄35+3周，剖宫产后8分钟，于2020年8 月24 日入院。患儿系G 4 P 4，因母亲羊水过少、易栓症剖宫产出生，出生时无产伤及窒息史。父母体健，非近亲结婚，姐姐9 岁，体健。入院体格检查：一般情况及反应差，肢体活动少，哭声低弱，全身皮肤发绀，皮肤散在胎脂，口周稍发绀，呼吸节律不规则，吸气三凹征阳性，双肺呼吸音偏低，心腹未见异常，四肢肌张力稍弱，原始反射未引出。入院时患儿全身皮肤发灰，予复苏囊加压辅助通气及吸痰肤色转红润。入院实验室检查：血常规白细胞6.2×109/L，红细胞4.97×1012/L，血红蛋白187 g/L，血小板297×109/L；血气分析pH 值 7.26，氧分压91 mmHg，二氧化碳分压28.5 mmHg，钾7.31 mmol/L，钠128 mmol/L，氯89 mmol/L，钙0.55 mmol/L，镁0.97 mmol/L，磷1.93mmol/L，乳酸 12.5 mmol/L，碳酸12.5 mmol/L，剩余碱-13.1 mmol/L。胸片疑似新生儿呼吸窘迫综合征，心影外型增大。血气分析pH值波动于6.85～7.06，乳酸波动于22.0～26.9 mmo/L，碳酸波动于3.5～ 5.9 mmo/L，剩余碱波动于-24.6～-36.3 mmo/L；血乳酸12.5 mmol/L、血氨218.8 μmol/L；超敏C反应蛋白0.33 mg/L，IL-6 14.99 pg/mL；总蛋白48.9 g/L，白蛋白32.6 g/L，总胆红素53.7 μmol/L，直接胆红素12.5 μmol/L，丙氨酸氨基转移酶5 U/L，天冬氨酸氨基转移酶42 U/L，γ-谷氨酰转肽酶366 U/L；乳酸脱氢酶536 U/L，α-羟丁酸脱氢酶371 U/L，肌酸激酶439 U/L，肌酸激酶同工酶25.73 ng/mL；肾功能未见异常；B型钠尿肽前体36 000 pg/mL。血串联质谱及尿气相色谱-质谱示多种氨基酸增高，尿多种氨基酸增高，需要鉴别是否为线粒体疾病，建议基因检测以便鉴别诊断。头颅彩超示第三脑室增宽（约8 mm），余未见异常。入院第3天复查头颅彩超示第三脑室增宽（约10 mm），余未见异常。肝胆胰脾、双肾及输尿管彩超未见异常。心脏彩超肺动脉高压（50 mmHg）；入院第4天复查心脏彩超肺动脉高压（76 mmHg），较前升高。

患儿入院后予经鼻持续气道正压通气辅助通气、暖箱保暖、静脉营养、预防出血、抗感染、西地兰强心、多巴胺维持血压、碳酸氢钠纠正酸中毒治疗后代谢性酸中毒难以纠正；入院第5天予包括辅酶Q10、核黄素、维生素E及C在内的鸡尾酒治疗后复查血气分析好转，辅助通气下经皮脉氧饱和度不稳定，予气管插管有创呼吸机辅助通气下经皮脉氧饱和度维持在80%左右；但患儿心率仍反复下降，肝脏较入院时增大，复查凝血功能明显低下，予冷沉淀对症治疗。因患儿病情持续危重，家属放弃治疗后患儿死亡。

因患儿反复高乳酸血症、血串联质谱及尿气相色谱-质谱提示线粒体疾病可能，经医学伦理审核，并获得家长知情同意后，采集患儿外周血 4 mL 及其父母外周血2 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，送北京康旭医学检验有限公司进行基因检测。

提取患儿及其父母基因组DNA，使用 Illumina 高通量测序仪和 Agilgent 公司的 SureSelect 探针富集体系进行二代基因检测。使用软件 CASAVA（1.8.2）将原始数据转化为可识别碱基序列，然后进行Align 分析、SNP 分析和DIP 分析，获得靶向区域变异位点信息。通过PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster进行蛋白质损伤分析，获得需要进一步验证变异位点。在人类基因组数据库GenBank中获得IDS基因变异位点基因序列，在引物设计网站 Primer Z（http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/ primerz4.do）设计并合成引物。对变异位点进行PCR扩增后进行一代测序验证，排除二代测序假阳性位点。

测序分析发现患儿ACAD 9基因第12 内含子c.1278+1G>A杂合剪切变异，该变异导致该基因的编码序列第1278位碱基后的第1个碱基G（位于内含子区域）变异为A，距离该外显子边界（c.1287）1 bp 的位置；ACAD 9基因第9 号外显子上的c.895 A>T（p.Ile 299 Phe）杂合错义变异，导致ACAD 9基因所编码的第299 个氨基酸由异亮氨酸变为苯丙氨酸。蛋白功能损伤预测中c.1278+1 G>A：SIFT：“-”，Polyphen 2“-”，MutationTaster 有可能致病；c.895A>T：SIFT示有可能致病，Polyphen2有可能致病，MutationTaster示有可能致病。上述变异可能导致蛋白质功能受到影响，两个变异均尚未见文献报道（参考数据库：HGMD Pro、PubMed及ClinVar）。该变异不属于多态性变化，在人群中发生频率极低（参考数据库 1000Genomes及dbSNP）。家系验证结果显示，患儿c.1278+1 G>A剪切变异遗传至母亲，母亲为杂合变异，父亲未发现该基因位点变异；c.895 A>T 错义变异遗传至父亲，母亲未发现该基因位点变异；两种变异形成复合杂合变异，符合线粒体复合物Ⅰ缺乏症核基因变异的常染色体隐性遗传方式（图1、2）。

图1 ACAD9 基因c.1278+1G>A 变异测序图

图2 ACAD9 基因c.895A>T 变异测序图

根据美国医学遗传学与基因组学学会联合美国分子病理学会2015 年制订的《基因序列变异的解释标准和指南》进行致病性分析[4]。ACAD 9基因c.1278+1 G>A 的致病性：①c.1278+1 G>A 变异为±1 或 2 位置的剪切变异，为致病变异（非常强致病性证据，PVS 1）；②c.1278+1 G>A 变异通过比照ESP 数据库、千人基因组数据库、EXAC 数据库中正常对照人群中未发现（或隐性遗传方式中频率极低）的变异（中等致病性证据，PM 2）；③综合上述c.1278+1 G>A变异的证据强度为“PVS1+PM2”，判断为导致受检者发病的疑似致病性变异。ACAD9基因 c.895A>T的致病性：①c.895A>T位于突变热点和/或位于已知无良性变异的关键功能区域（中等致病证据，PM 1）；②c.895 A>T 变异通过比照ESP 数据库、千人基因组数据库、EXAC 数据库中正常对照人群中未发现（或隐性遗传方式中频率极低）的变异（中等致病性证据，PM2）；③c.895A>T变异经多种算法预测会对基因或基因产物功能造成有害影响的变异（支持致病证据，PP3）；④综合上述c.895A>T变异的证据强度为“PM1+PM2+PP3”，判断为导致受检者发病的临床意义不明性变异。但ACAD 9基因c.895 A>T 变异位点SIFT、Polyphen2及MutationTaster均预测为有可能致病。尽管目前尚无文献报道且判断为临床意义不明，但亦未有无致病性的定论，需待日后进一步行相关验证。

结合患儿临床表现及基因检测分析诊断ACAD 9基因c.1278+1G>A和c.895A>T复合杂合变异所致的MC1DN20基本明确。

2 讨论

ACAD9基因定位于3q21.3，基因组全长约33.50 kb，包含18个外显子。目前MC1DN20基因变异类型多以复合杂合及纯合变异为多见。ACAD 9基因编码的酰基辅酶A 脱氢酶9（ACAD 9）是线粒体呼吸链复合体I（complex I，CI）的组装因子，ACAD9基因变异是CI 缺乏的常见原因，ACAD 9 在体外对长链脂肪酸也保持酶ACAD活性，但这一功能的生物学相关性仍存在争议，部分原因是ACAD9的组织特异性表达，在肝脏和神经元中高表达，而在皮肤成纤维细胞中表达最少。研究显示，在表达高水平ACAD9细胞中，酶促ACAD 活性是完全脂肪酸氧化能力所必需，而功能丧失决定ACAD9缺乏患者的表型中很重要[5]。ACAD9缺陷患者的治疗应以治疗CI 与脂肪酸氧化功能障碍为主。

国内曾有报道通过二代测序技术发现1 例因ACAD 9基因所致的线粒体疾病，但患者年龄、性别及具体变异类型不详；另有报道1 例ACAD 9基因c.797G>A（p.Arg266Gln）和c.1359-1G>A复合杂合变异所致的儿童线粒体疾病相关癫痫[6]。

德国曾报道4 例线粒体复合物Ⅰ缺乏症患儿，其中包括2 例同胞[7]。在2 例同胞中，姐姐出生后不久就出现心肺功能下降、肥厚性心肌病、脑病和严重乳酸酸中毒，并在出生第46 天死亡，其肌肉中的复合物Ⅰ活性降低至9%～14%，肝脏中的复合物Ⅰ活性降低至1%，成纤维细胞中的复合物Ⅰ活性降低至32%～39%；弟弟出生时表现低血压、心肌肥大和乳酸性酸中毒，给予积极的核黄素治疗后临床反应良好，5岁时认知障碍，精神运动发育无异常；这2 例同胞是ACAD9基因p.Phe44Ile和p.Arg266Gln复合杂合变异。另2例女童，均有肥厚性心肌病、脑病和乳酸酸中毒，分别在2岁和12岁时死亡，基因检测发现分别为ACAD9基因的p.Ala326Pro和p.Arg532Trp复合杂合变异、p.Arg266Gln和p.Arg417Cys的复合杂合变异。另一家系中3 例线粒体复合物Ⅰ缺乏症患儿，均患有肥厚性心肌病、低血压、乳酸性酸中毒和运动不耐症，其中1例肌活检复合物Ⅰ活性为正常3%，基因测序发现ACAD9基因c.1594C>T（p.Arg532Trp）纯合 变异[8]。

美国曾报道3 例线粒体复合物Ⅰ缺乏症，表现为偶发性肝功能不全，同时伴有慢性神经功能障碍。其中1 例14 岁患儿死于轻度病毒性疾病和服用阿司匹林引起的Reye样发作和小脑卒中，尸检结果显示弥漫性肝微泡性脂肪变性、脑部弥漫性水肿；ACAD9基因检测发现第1个ATG上游44个bp的4 bp插入。1例10岁女孩，4月龄首次出现暴发性肝衰竭，随后出现急性肝功能不全和低血糖。还有1例4.5岁女童，死于心肌病，其同胞在22月龄时也死于心肌病。但这2例未行基因检查。

还有报道来自3个无血缘家庭的9例线粒体复合物Ⅰ缺乏症患儿，包括7例女孩和2例男孩。大多数患儿在新生儿期出现乳酸性酸中毒，并在婴儿期死亡。除先前报道的肥厚性心肌病外，5例患者（来自2个家庭）有动脉导管未闭。家系Ⅱ的2例患儿在儿童时期出现运动不耐受，伴有轻度左心室肥大，在核黄素治疗下临床症状稳定。家系Ⅰ的二代测序发现ACAD 9基因c.1636G>C（p.Val546Leu）纯合变异，家系Ⅱ的二代测序发现ACAD9基因c.509C>T（p.Ala170Val）和c.1687C>G（p.His563Asp）复合杂合变异，家系Ⅲ的二代测序发现ACAD9基因c.1240C>A（p.Arg414Ser）and c.1650_1672dup（p.Leu558Profs*45）复合杂合变异[9]。

上述文献复习证实线粒体复合物Ⅰ缺乏症常导致多系统损害，临床表现多样。本例患儿临床表型主要是顽固性代谢性酸中毒及乳酸性酸中毒，基因检测发现ACAD9基因的c.1278+1G>A和c.895A>T复合杂合变异，支持文献报道，但患儿病情危重，未行头颅MRI检查，且患儿肝脏逐渐增大考虑也与心力衰竭有关。本例患儿虽予碳酸氢钠纠正酸中毒但无明显疗效，而予核黄素治疗后血气分析好转。

尽管尚无法明确ACAD9基因c.1278+1G>A和c.895A>T变异位点的致病性，但患儿有MC1DN20典型的临床表现，且c.1278+1G>A和c.895A>T变异（尽管目前c.895A>T尚无文献报道且判断为临床意义不明，但亦未有无致病性的定论，需待日后进一步行相关验证）不属于多态性变化，在人群中发生的频率极低（所参考数据库 1000 Genomes及dbSNP）。故综合考虑患儿基因检测结果及临床表型，可基本确认ACAD9基因c.1278+1G>A和c.895A>T变异位点为患儿的致病性变异。