转录因子FOXP2调控先天性巨结肠相关基因表达的生物信息学分析

卢艳娇 崔梦梦 郁雯雯 褚 迅

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 上海市小儿消化与营养 重点实验室（上海 200092）

先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HSCR）是儿童常见的先天性消化道畸形，由于肠神经系统发育过程中肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells，ENCCs）与肠神经细胞增殖、迁移或者分化发生缺陷引起。HSCR 表现为结肠不同长度肠段的肠神经节缺乏，远端无神经节细胞肠段狭窄，近端肠段扩张形成功能性阻塞。中国人群HSCR的发病率约为1/5000，男女比例为4∶1。研究显示HSCR是由多基因引起的遗传性疾病，其主要致病基因为RET基因，其他遗传变异与RET相互作用导致疾病的发生。50.0%家族性HSCR、7.3%～20.0%散发性HSCR与RET基因变异有关，所以HSCR又被认为是一种寡基因疾病。已发现的疾病相关基因分为以下3类：①与RET分子通路相关基因（RET、GDNF、GFRA1、NTN、PSPN等）；②EDNRB通路相关基因（EDNRB、ECE1、EDN3）；③调控肠神经发育的转录因子（PHOX2B、SOX10等）[1]。然而仅有30%的HSCR患者含有这些基因变异，这些患者多有家族性倾向。已发现的常见疾病遗传变异仅能解释散发病例的部分遗传因素，因此需要更多研究去发现相关疾病基因及其信号途径。

肠神经系统形成过程复杂，其中任何一步出现异常都可能影响肠神经系统发育，进而导致HSCR的发生。转录因子在肠神经系统发育过程中的作用至关重要。性别决定区Y 基因相关高可变区基因10（sex determining region Y HMG box 10，SOX10）编码一种SPY 转录因子，在胚胎发育早期的神经管中，迁移中的神经嵴细胞以及成熟的神经胶质中均有表达，SOX 10单倍型剂量不足导致最初定居在肠内的肠神经嵴细胞数量减少，最终引起结肠无神经元定植。此外，SOX 10调控RET/EDNRB 通路基因表达，影响相关的表达，从而导致肠神经的发育异常[2]。PHOX 2 B（paired-like homeobox 2b）编码一种高度保守的转录因子同源域蛋白，在神经嵴来源的自主神经系统中表达，是调控RET表达的关键转录因子。与肠神经系统发育有关的其他转录因子还有PAX3（paired box 3）和ZFHX1B（zinc finger homeobox 1b）等[3]。先前的研究发现这几个转录因子都与HSCR的发病相关。为了进一步发现与肠神经发育相关有可能影响HSCR发生的其他转录因子，本研究基于生物信息学数据库全面预测分析与肠神经发育相关的转录因子，进而通过实时定量PCR方法检测其在HSCR患儿肠道狭窄段与扩张段表达的差异，探讨其影响HSCR发生发展的可能性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2019年1月至2020年10月在上海交通大学医学院附属新华医院接受手术治疗的30 例HSCR 患儿的临床资料，并在巨结肠切除术中留取扩张段与狭窄段结肠组织。入选患儿均根据病史、钡剂灌肠检查、术中冰冻切片以及术后病理学检查确诊为HSCR[4]，且均为短段型巨结肠。术中进行病理学检查，在远端无神经节细胞处取狭窄段肠段，在病理学检查提示有神经节细胞处取扩张段肠段。入选患儿均为汉族，均为散发性，无家族史，无其他消化道畸形。

本研究经上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理审查委员会审查并同意，所有参与者父母均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料及标本收集 收集HSCR患儿的一般资料，如性别、年龄等。于患儿巨结肠切除术中，遵循无菌操作原则留取扩张段与狭窄段结肠组织，迅速冻存于液氮中，置-80 ℃冰箱保存。

1.2.2FOXP 2mRNA 的表达 采用荧光定量PCR 检测。使用QIAGEN 的RNeasy®Mini Kit 分别对30例HSCR患儿狭窄段和扩张段肠管进行总mRNA 的提取与定量。mRNA 用 TaKaRa 反转录试剂盒逆转成cDNA并存于-20℃备用。用TaKaRa 的SYBR Green®Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒作为qRT-PCR 反应体系，每个样本设置3 个副孔。在QuantStudio Dx Real-Time PCR（Applied Biosystems，美国）仪器上进行qRT-PCR 反应，用QuantStudio Dx Software导出数据结果。FOXP2上游引物为5′-CTGGCAGCAGAGATGGAAGA-3′，下游引物为5′-CACCTGCAGTGGTCTCTGTT-3′，以GAPDH作为内参基因，上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′[5]。

1.2.3 转录因子富集分析 ChEA3（https://amp.pharm.mssm.edu/ChEA3）是一个对调控基因表达的转录因子进行预测富集的数据库，其整合了ENCODE、ReMap以及一些独立发表的CHIP-seq 数据，还整合GTEx、TCGA 以及ARCHS 4 中RNA-seq 数据内的共表达转录因子数据，另外还包含Enrichr数据库内基因之间的转录因子共发生的数据[6]。因此，使用ChEA3在线工具对调控HSCR易感基因表达的转录因子进行预测以及富集分析。

采用ChEA3在线工具，对已报道的119个巨结肠相关基因的转录因子进行预测与富集分析。ChEA3数据库分析得到的是综合多个数据库结果，不同数据库对于所得基因的排名都有所差异。按照默认的Mean Rank排名方式即综合多个数据库得到的平均排名对所得结果进行进一步分析，Mean Rank分数越小所预测的把握度越高[6]。

1.2.4 转录因子组织特异性表达分析 人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）网站提供24 000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息。数据是通过免疫组学技术检测每一种蛋白质在48种人类正常组织、20种肿瘤组织、47个细胞系和12种血液细胞内的分布和表达，其结果用免疫组化染色图表示，并经过专业人员阅读和标引。这些受检组织来自144个不同个体和216个肿瘤组织，保证染色结果具有代表性[7]。在本研究中，将前面分析所得的转录因子FOXP 2 在组织数据库中检索，分析FOXP 2的mRNA 与蛋白在人体各个器官组织中的表达情况，并着重观察其在肠道内不同细胞中的表达分布情况。

1.2.5 GeneMANIA分析 GeneMANIA在线软件可以用来构建蛋白-蛋白相互作用网络并预测已定义基因的潜在功能。结果可以显示基因之间的关系，包括共表达、物理相互作用、共定位以及基因间相互作用等[8]。根据转录因子预测结果，使用GeneMANIA 来构建FOXP 2与其靶基因之间的蛋白-蛋白相互作用网络。

1.3 统计学分析

采用Graphpad Prism8.0软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差表示，t检验用来比较两组独立样本，P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

入选的30例HSCR患儿均诊断为散发型、短段型HSCR。其中，男23例、女7例（男女比例为3.29∶1），中位年龄为1岁。

2.2 转录因子分析

利用ChEA3，对Mean Rank排名的前30位转录因子进行组织分布分析，之后再进行Go 功能注释及富集分析，结果显示这些转录因子多分布于脑部、皮肤、结肠等组织内，并且Go 富集分析显示与中枢神经系统发育、胚胎期器官形成、表皮细胞发育以及胶原纤维的过程相关。在Mean Rank排名前30位转录因子中，排名第20 位的FOXP 2是唯一一个基于ChEA 3 所有数据库均预测出的转录因子（图1）。这些数据库包括：GTEx、ARCHS4共表达数据库、Enrichr共发生分析数据库、ReMap、ENCODE及一些已发表的CHIP-seq数据。此外，已有大量生物学证据显示调控肠神经发育并参与HSCR 发病的转录因子PHOX 2 B和SOX 10分别位于第3位和第65位，分别调控42个和27个基因，结果增加了所预测的转录因子FOXP 2调控HSCR 相关致病基因的可信度。

图1 ChEA3 数据库分析基于Mean Rank 排名的前30 位的转录因子

预测结果显示FOXP 2调控119 个候选基因中的46个，主要包括Hedgehog信号通路的GLI3、PTCH1、HES 1、KLF 4，Notch 信号通路的JAG 1、JAG 2、NOTCH 1、NOTCH 2、NOTCH 3，RET 信号通路的GDNF、GFRA 1以及NRG 1、ERBB 4等一些其他通路的相关基因。GeneMANIA数据库构建的蛋白-蛋白相互作用网络显示FOXP2与GLI3共表达，与PTCH1、ERBB4、EDNRB、ECE1、TGFB2、SERPINI1存在基因间相互作用，这些结果提示FOXP 2极有可能通过调控HSCR关键因子的基因表达而参与肠神经系统发育过程。

2.3 HPA数据库分析

从HPA数据库获得了FOXP2在44个组织器官中蛋白表达情况，其中在小脑、消化道、膀胱以及平滑肌中表达较高。另外，综合HPA、GTEx、FANTOM 5 这三个数据库的RNA数据发现，FOXP2的RNA表达量在平滑肌中最高，其次是膀胱，然后便是结肠。通过查询HPA 数据库的免疫组学数据发现，FOXP 2 蛋白在大脑皮质内皮细胞中度表达，而在神经元细胞中高表达，并且在结肠肌层的神经节细胞以及腺细胞中呈现强阳性染色。FOXP2在脑神经元细胞以及肠神经节细胞及肠壁组织内的高表达，进一步表明FOXP 2可能参与肠神经系统发育过程，FOXP2表达水平变化有可能影响HSCR发生。

2.4 FOXP2在肠道组织内的表达

qRT-PCR结果显示FOXP2在30例HSCR狭窄段肠管中相对表达量为0.89±0.40，在扩张段肠管中相对表达量为1.49±0.90，两者差异有统计学意义（t=5.819，P<0.001）。

3 讨论

研究显示，HSCR 是以RET为主要疾病基因的寡基因遗传性疾病，其病因及发病机制目前尚不完全明确。目前研究认为，在肠神经系统发育过程中，肠神经嵴细胞增殖、迁移和分化过程发生异常会导致远端肠道肌间神经丛和黏膜下神经丛内神经节细胞缺如，从而导致HSCR。肠神经发育需要相关的多个通路基因在时空顺序上准确有序表达，在此过程中转录因子起到关键作用[3]。转录因子是基因表达调控和细胞信号转导过程中必不可少的因子，在器官组织发育与疾病发生过程中起非常重要的作用。文献分析显示119 个基因与HSCR 的发病相关，包括RET 信号通路、EDNRB信号通路、Notch信号通路、Neuregulin信号通路、Hedgehog信号通路、Semophorin信号通路、Prokinecticin信号通路以及其他一些与肠神经系统发育相关的基因。本研究利用生物信息学数据库分析调控HSCR 相关基因的转录因子，通过ChEA 3 数据库分析发现转录因子FOXP2对46个疾病相关基因的表达具有调控作用，HPA 数据库显示转录因子FOXP 2在脑神经元细胞和结肠壁组织中高表达，提示转录因子FOXP2可能参与神经发育的调控。在此基础上，利用qRT-PCR技术检测发现FOXP2在30例HSCR患儿的狭窄段肠管中mRNA表达量明显降低，因此推测狭窄段神经节细胞缺如可能与FOXP2的表达水平降低 有关。

FOXP2蛋白编码715个氨基酸，其中C端包含具有DNA结合能力的forkhead-box结构域，以及具有锌指和亮氨酸拉链结构基序，其N 端则富含谷氨酰胺，蛋白结构的复杂性决定了其功能的多样性，因此，当FOXP 2 功能发生异常时可能改变其下游大量靶基因的表达异常，导致疾病的发生[9]。转录因子FOXP2作为Forkhead蛋白家族成员之一，不仅参与心脏、肠道、食管、骨以及肺脏等多个组织器官的发育，而且还参与早期大脑皮质发育与神经干细胞迁移和分化[10]。FOXD1、FOXD3、FOXA3以及FOXP1同为Forkhead蛋白家族成员，已有研究显示这些转录因子与肠道神经嵴细胞的分化有关[11]。研究发现FOXP2发生错义变异会破坏其DNA 结合位点结构域，从而干扰其结合并调节靶基因的能力。FOXP2变异可导致发育性言语运动障碍和儿童言语失用症的发生，并可伴有神经肌肉系统发育异常、头面部发育异常、骨骼发育畸形。少数病例还会出现智力低下甚至有孤独症表现。一项在澳大利亚人群中对709例精神分裂症患者进行关联研究发现1个位于FOXP2上的SNP（rs2189008）与语言障碍相关联[12]。这些临床表现表明其变异或者异常表达与神经系统的发育异常相关联[13]。

Hedgehog通路是肠道器官形成以及肠神经系统发育过程中重要信号通路。在小鼠动物模型中，抑制Hedgehog信号通路会导致肠神经节发育异常，从而导致HSCR或其他胃肠道畸形。另外，Hedgehog信号通路的异常激活会导致肠道神经嵴细胞来源的神经胶质细胞过早生成，从而影响肠神经嵴细胞的增殖、迁移和分化[14]。使用GeneMANIA 网站构建与FOXP2相关的蛋白-蛋白相互作用网络，发现FOXP2与GLI 3 共表达，说明FOXP 2 与GLI 3 在功能上有可能相关联。GLI 3 与同家族的GLI 1 和GLI 2 均是介导Hedgehog通路信号的转录因子。其中，GLI1是下游靶基因的激动剂，而GLI2和GLI3既是激动剂又是抑制剂，GLI2偏向激动剂作用，GLI3则偏向抑制剂作用[15]。使用转基因小鼠模型，将GLI 1异位过表达致使小鼠出现类似HSCR 的表型，其中肠神经系统发育的受影响程度与GLI1表达水平相关。有研究发现GLI3基因的错义变异改变其编码蛋白的功能，导致HSCR 的发生；同时利用对斑马鱼以及小鼠模型，发现Ihh（Indian Hedgehog）的缺失会导致类似HSCR的表型[16]。这些研究表明，GLI的表达水平与GLI3的蛋白功能改变以及Hedgehog信号通路活性变化对肠神经系统发育与HSCR发生至关重要。跨膜蛋白Smo（Smoothened）是Hedgehog信号转导必不可少的因子，Hedgehog结合PTCH1释放Smo活性，并促进下游GLI激活剂的形成，激活下游级联反应。PTCH1基因变异会导致HSCR风险明显增高，并且使用小鼠动物模型发现Ptch 1的敲除会造成小鼠神经胶质细胞过早发生，而导致神经嵴细胞明显减少，从而降低迁移过程中的肠神经节细胞的密度，影响肠神经细胞的迁移[17]。FOXP2与GLI及PTCH1基因功能相关联，因此推测FOXP2有可能通过调控这2个基因的表达继而调控Hedgehog信号通路，作用于神经嵴细胞的分化与迁移过程，参与HSCR发病进程。

本研究也提示，FOXP 2通过其他分子途径参与肠神经系统发育过程。EDNRB 和ECE 1 是EDNRB 信号通路的重要因子，对肠神经系统的发育至关重要，ERBB4是NRG1的受体，是神经嵴细胞发育过程中的分子调节剂，参与神经元的迁移与分化过程[18]。预测结果显示FOXP2也参与这些基因的表达调控。

综上所述，通过生物信息分析提示FOXP 2可能参与调节肠神经系统发育过程，并发现FOXP 2基因表达水平在HSCR病变组织中显著下降，揭示FOXP2有可能与HSCR发生相关。进一步通过临床样本研究FOXP 2遗传变异与HSCR 发病风险的相关性以及可通过基因敲低或者敲除的动物模型来进一步探索该基因对肠神经发育的影响，有可能为揭示HSCR 发病机制提供线索。