丹参饮预处理对缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞的保护作用及对血浆氧化三甲胺水平的影响

任耀龙，郑 刚，赵明君，杨 磊，钟 伟，齐 婧，刘东敏，徐佳萌，尤金枝，李莹超

急性心肌梗死是常见的严重威胁人类生命安全的心血管系统急危重症，临床治疗的首要任务是尽快开通罪犯血管，恢复心肌血流灌注。然而，伴随而来的心肌缺血/再灌注损伤严重制约了病人临床获益[1]。肠道菌群被称为“人体元基因组”，与宿主之间存在密切的信息交流，在代谢、免疫、心血管系统方面的调控发挥着重要作用[2]。氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)是食物中胆碱、卵磷脂、左旋肉碱等经肠道菌群作用后产生的代表性代谢产物，可促进冠心病发病及不良主要心血管事件发生[3]。丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁组成，具有活血祛瘀、行气止痛等功效，主治心痛、胃脘诸痛，已广泛用于冠心病及消化系统疾病的临床治疗，并取得确切的临床疗效[4-5]。基于此，提出丹参饮调控肠道菌群保护心肌缺血/再灌注损伤的学术假说，本研究观察丹参饮预处理对SD大鼠在体心肌缺血/再灌注模型肠道菌群的代表性代谢产物TMAO和血清心肌酶、N末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)及心肌组织形态学的影响，探讨中医经典名方丹参饮对缺血/再灌注心肌细胞的保护作用及对模型动物血浆TMAO水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择无特定病原体(SPF)级健康成年SD大鼠50只，雌雄各25只，体质量180～210 g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2015-030。实验动物饲养于陕西中医药大学协同创新中心SPF级动物实验中心，给予标准饲料及饮用水喂养7 d后用于实验。

1.2 实验药物与试剂 实验用丹参饮由丹参15 g、檀香15 g、砂仁10 g组成，实验药物均购自陕西中医药大学附属医院中草药房。药物制备：精确称取生药40 g，加12倍自来水，浸泡30 min，按质量/体积=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)后，药液以1 000 r/min离心10 min除杂质，浓缩为含生药量1 g/mL，4 ℃下密封冷藏备用。肌酸激酶同工酶(CK-MB)和NT-proBNP试剂盒[艾莱萨生物科技(上海)有限公司，批号：20191231]，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20191228)，甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 实验仪器 PL3508/P八通道研究型高速记录系统；SC-5型小动物呼吸机；Bio-Tek ELXSOSIU型全自动酶标仪；CR22GⅡ型高速冷冻离心机；Leica VT1000 S振动切片机；TC-120S+生物组织自动脱水机；TR-180生物组织自动染色机；Nikon TS100-F(配DS-5MC)IX73-U型倒置荧光数码显微镜；MS105DU半微量电子天平；Direct-Q⑤5纯水/超纯水一体机系统；D3024R高速微量冷冻离心机；JP-040S超声波清洁器；MX-F旋涡振荡器；MTV-100多管旋涡混合仪；TSQ Quantum三重四极杆质谱仪；UlitMate3000rs色谱仪；0.5～10.0 μL、2.0～20.0 μL、20.0～200.0 μL、200.0～1 000.0 μL移液器。

1.4 TMAO检测方法及条件 从含EDTA的全血中分离出1 mL血浆，置于-80 ℃冰箱冻存待检。采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定血浆TMAO浓度。质谱条件，离子源：电喷雾电离源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：选择反应监测；电喷雾电压4 000 V；毛细管温度350 ℃；碰撞气：高纯氩气(纯度≥99.999%)；鞘气：氮气(纯度≥99.999%)，40 Arb；辅助气：氮气(纯度≥99.999%)，15 Arb；数据采集时间5 min。色谱条件如下，色谱柱：Waters T3 150×2.1 mm，3 μm，Waters；流速：0.3 mL/min；水相：0.1%甲酸/10 mmol/L甲酸铵；有机相：0.1%甲酸/乙腈；柱温箱温度：40 ℃；自动进样器温度/体积：8.0 ℃/5 μL。取血浆50 μL，加入甲醇150 μL，涡旋混匀10 min，以15 000 r/min离心10 min，取上清液进行分析。化合物色谱图采集和积分运用软件Xcilabur 3.0(Thermo)进行处理，以1/X2为加权系数进行线性回归。

1.5 动物分组及给药 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组及丹参饮低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，雌雄各5只。给药方案，假手术组：给予等体积生理盐水每日2次，连续灌服14 d后手术，只穿线不结扎冠状动脉；模型组：开胸结扎前降支，余同假手术组；丹参饮低剂量组(5 g/kg生药量)、中剂量组(10 g/kg生药量)、高剂量组(15 g/kg生药量)，各组均配制成10 mL/kg药液，每日2次，连续灌服14 d后手术。

1.6 动物模型制备 实验动物模型制备参考文献[6]并进行改进，具体操作方法：大鼠实验前12 h禁食不禁水，将10%水合氯醛以3.5 mL/kg剂量腹腔注射实施麻醉后仰位固定于动物解剖台上，正确连接Medlab信号采集系统，监测Ⅱ导联心电图，气管切开行气管插管，连接小动物呼吸机(潮气量2.5 mL，呼吸频率70次/min，呼吸比1∶2)，观察稳定5 min后于胸骨左缘约0.5 cm处开胸，剪断第4肋，刺破胸膜充分暴露心脏，剪开心包后将心脏挤出胸腔，于左心耳与肺动脉圆锥交界处高位以0号手术线缝针穿过前降支，同时将直径1 mm的聚乙烯管置于手术线与前降支之间，拉紧手术线使聚乙烯管压迫前降支造成急性心肌缺血模型，观察心电图ST段抬高>0.1 mV为结扎成功。心肌缺血45 min后去除聚乙烯管恢复前降支灌注，以心脏表面颜色转红，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功，再灌注180 min后腹主动脉取血，并快速摘取心脏用于心肌组织样本检测。假手术组手术过程与模型组相同，但只穿线不结扎冠状动脉。

1.7 血液标本采集 再灌注3 h后于腹主动脉取血，血液标本以3 000 r/min离心后取上清液分装，置于-80 ℃冰箱冷冻备用，实验全部结束后严格按照试剂盒操作测定血清LDH、CK-MB、NT-proBNP及TMAO等生化指标。

1.8 苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理变化 采血后快速摘除心脏，取缺血心肌组织，置于10%甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，HE染色后进行光学观察，采集图像进行分析。

2 结 果

2.1 大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型各阶段心电图表现 本研究详细记录了整个实验过程各组大鼠心电图表现。详见图1。

图1 心肌缺血/再灌注损伤模型大鼠各阶段心电图(A为结扎大鼠前降支，心电图表现为ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；B为45 min后取出聚乙烯管给予前降支再灌注，出现再灌注后室性心律失常及Q波；C为再灌注180 min后心电图表现为ST段回落，病理性Q波形成)

2.2 各组大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，丹参饮低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与丹参饮低剂量组比较，丹参饮中剂量组、丹参饮高剂量组大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与丹参饮中剂量组比较，丹参饮高剂量组血清CK-MB、LDH与NT-proBNP水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较，模型组及丹参饮预处理组血浆TMAO表达均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，丹参饮预处理组TMAO表达均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比较(±s)

2.3 对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织病理学的影响 对大鼠缺血区心肌进行HE染色，观察各组心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞形态学改变，结果显示：模型组心肌纹理紊乱，心肌细胞正常结构明显被破坏，丹参饮预处理组可明显改善这一病理表现，并随着丹参饮剂量增加，改善作用明显增强。详见图2。

图2 心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织HE染色图

3 讨 论

随着人口老龄化程度加剧和居民生活水平的提高，我国心肌梗死发病率呈升高趋势，已成为威胁人民生命安全的重大公共卫生问题。《中国心血管病报告2018》数据显示：我国每年有29.5万人次因心肌梗死住院，2017年我国急性心肌梗死住院总费用高达190.85亿元，严重影响国民生活质量，增加了病人的经济负担[7]。心肌梗死的临床救治以尽早开通罪犯血管，及时恢复冠状动脉血流为目标。然而，恢复血流后的心肌缺血/再灌注损伤进一步加大心肌梗死面积，诱发恶性心律失常，降低心功能，是心血管研究领域亟待解决的问题之一。

近年来，国内外学者针对心肌缺血/再灌注损伤的具体生理病理机制开展了大量研究，一般认为心肌缺血/再灌注损伤的发生与细胞凋亡、心肌能量代谢障碍、内皮细胞功能障碍、氧自由基暴发、细胞内钙超载、中性粒细胞浸润等有关[8]，但确切的病理生理机制尚不清楚。有研究显示，肠道菌群的典型代谢产物TMAO与动脉粥样硬化形成有关，急性冠脉综合征病人血浆TMAO水平明显增高[9]。血浆TMAO含量升高与急性冠脉综合征病人主要不良心脏事件(如心肌梗死、脑卒中、需要血运重建)呈正相关[10]。由此可见，血浆TMAO可能是心肌梗死的潜在治疗靶点。

目前，中医药广泛应用于心肌缺血/再灌注损伤的防治，药理学已证实，多种中药单体及中药复方针对心肌缺血/再灌注损伤可有效减少心肌凋亡，减轻心肌细胞线粒体损伤，调控自噬过程，调节内源性一氧化氮表达，抑制炎症反应，多角度发挥心肌细胞保护作用[11]。丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁组成，具有活血祛瘀、行气止痛的功效，主治心痛及胃脘诸痛，广泛用于心血管系统及消化系统疾病的临床治疗，是治疗心肌梗死的常用经典基础方剂之一，并取得满意的临床疗效。因此，从肠道菌群角度出发，提出丹参饮通过调控肠道菌群改善缺血/再灌注心肌损伤的学术假说，采用丹参饮预处理心肌缺血/再灌注损伤模型大鼠，探讨丹参饮对心肌缺血/再灌注损伤模型大鼠心肌细胞保护作用及对实验动物肠道菌群代表性代谢产物TMAO水平的影响。

本研究采用前降支结扎方法制备大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，研究过程可观察到典型的急性心肌梗死心电图演变过程，部分大鼠再灌注阶段记录到典型的室性心动过速心电图表现，说明造模成功。本研究结果显示，与模型组比较，丹参饮预处理组血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低(P<0.01)，且随着丹参饮浓度递增该表现更显著，说明丹参饮预处理可显著降低心肌缺血/再灌注损伤模型大鼠心肌酶学水平，保护心功能，且高浓度丹参饮保护作用更显著。同时对实验大鼠缺血区域心肌细胞进行HE染色，观察心肌细胞形态学改变，结果还显示：模型组心肌纹理紊乱，心肌细胞正常结构明显被破坏，丹参饮预处理可明显改善这一病理表现，且随着丹参饮剂量增加，改善作用明显增强，从病理学角度说明丹参饮预处理保护心肌缺血/再灌注损伤模型大鼠心肌细胞的作用。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组与丹参饮预处理组血浆TMAO水平明显增高，说明结扎前降支可明显促进模型动物血浆TMAO表达，从动物实验角度进一步证实TMAO与心肌梗死的相关性；但丹参饮预处理组与模型组大鼠血浆TMAO水平比较均无明显变化，说明丹参饮预处理不能降低缺血/再灌注损伤模型大鼠血浆TMAO水平。

综上所述，本研究从心肌酶学及病理组织学角度明确丹参饮预处理对缺血/再灌注损伤心肌具有确切的保护作用，并可较好地保护心功能，但不能降低血浆TMAO水平。本研究从中药复方调控肠道菌群角度出发，探讨丹参饮保护缺血/再灌注损伤心肌的临床效应机制，为中医药防治心肌缺血/再灌注损伤开拓了新思路与新方法，今后将以肠道菌群为治疗靶点开展中药单体及中药复方防治心血管病的基础与临床研究，为中医药调控肠道菌群防治心血管疾病提供可靠的数据支撑和临床证据。