HS-GC-MS法分析醋香附挥发性化学成分

杨天歌，倪诗婷，高旭华，陶欧（北京中医药大学中药学院，北京 102488）

香附为莎草科植物莎草（Cyperus RotundusL.）的干燥根茎，气香，味辛、微苦、微甘，平；归肝、脾、三焦经；具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效[1]；主要成分为挥发油类、黄酮类、糖类、生物碱类、酚类和三萜类化合物[2]。其挥发油类成分具有镇痛、抗菌消炎、抑制子宫收缩、雌激素样作用等[3-4]。关于香附挥发性成分已有较多研究并且普遍为提取挥发油后进行GC-MS检测，王艳等[5]建立了12批香附药材挥发油的指纹图谱，方蕾等药理作用[6-7]参照挥发油测定法中的甲法结合GC-MS分别鉴定对比了药对香附-藿香和陈皮-香附的挥发油，齐菲等[8]采用GC-MS法对比了隔水和共水蒸馏对香附挥发油提取的影响。香附醋炙后，能增强其疏肝止痛之功效[9]。经文献检索，发现醋香附成分研究有提取挥发油的GC-MS法和HPLC检测等方法[10-11]。顶空进样（HS）-GC-MS法操作简便、快速、经济安全、无需溶剂[12]。采用顶空进样法可避免挥发油长时间提取造成的易挥发成分的损耗，醋香附经粉碎后即可装样测量，有利于节约时间，且直接气体进样能够更直观地反应醋香附气味特征，为醋香附进一步合理利用、质量评价、香附与醋香附气味对比提供一定的理论依据。

1 材料

7697A HS-7890B GC-5977A MS 型顶空进样-气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；BSA124S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；FW200 高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）。

醋香附（北京市金象大药房，批号：19112007，经北京中医药大学王晶娟教授鉴定为莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根茎醋炙后的饮片）。

2 方法

2.1 样品制备

将醋香附用高速万能粉碎机粉碎，过4号筛。称取醋香附粉迅速装入20 mL顶空进样瓶，加盖密封，待测。以空瓶加盖密封为空白对照。

2.2 仪器参数设置

GC条件：色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；样口温度为130℃，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%）；流速为1.0 mL·min－1；柱流量控制模式为恒流；升温程序（柱温初始50℃，以2℃·min－1升温至70℃，以10℃·min－1升至120℃，以3℃·min－1升至210℃；后运行温度230℃，5 min）。

MS条件：离子源为电子轰击离子源（EI），电离电压为70 eV，选择全离子扫描模式，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，接口温度为130℃；溶剂延迟0 min。

HS条件：孵育温度为120℃，定量环/阀温度为130℃，传输线温度为130℃，GC循环时间为55 min，孵育时间为40 min，进样量为1000 μL。

2.3 统计方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，以P＜0.05为差异有统计学意义[13-14]。

2.4 顶空进样条件的考察

2.4.1 称样量 参考文献[15-16]及仪器称样量限制，分别称取样品0.3、0.6、1 g，进行检测。不同称样量检测出总峰面积如图1所示。结果表明，称样量为1 g时，总峰面积最大。因进样瓶装量限制，因此称样量最大为1 g。

图1 称样量对峰面积影响Fig 1 Effect of sample weight on the peak area

2.4.2 顶空瓶孵育温度 分别考察80、90、100、105、120、140、160、200℃孵育温度对色谱峰数量与面积的影响。结果表明，孵育温度超过120℃时，样品颜色明显加深，出现变质现象，因此120℃以上的温度不考虑。在80、90、100、105、120℃各温度下，色谱峰数量逐渐增加，色谱图总峰面积如图2所示，呈增加趋势。

图2 孵育温度对峰面积影响Fig 2 Effect of incubation temperature on the peak area

2.4.3 正交试验设计 设计三因素三水平正交试验。综合考虑总峰面积、挥发油提取的温度和单因素试验，拟定正交因素水平见表1，结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平Tab 1 Orthogonal factor level

表2 L9(34)正交试验结果与分析Tab 2 L9(34) orthogonal test

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

极差分析结果表明，RA＞RC＞RB，即孵育温度影响最大，其次是称样量，孵育时间影响最小。但孵育时间对总峰面积影响不与时间成正比，在30 min时面积下降，推测其原因可能是样品孵育时，易挥发性成分最先挥发至瓶上端使上方气体浓度短时间升高，造成气体混合不均，随着时间增长，进样瓶中气体混合均匀，且较难挥发性成分得以挥发使最终总峰面积增大。由方差分析可知，A因素3个水平P＝0.022＜0.05差异有统计学意义，B和C因素（P＞0.05）对结果没有影响。综合极差分析结果，选取使总峰面积最大的参数为A3B3C3，即孵育温度为120℃，孵育时间为40 min，称样量为1.0 g。

3 结果与讨论

经GC-MS分析，得到醋香附挥发性成分和空白对照的GC-MS总离子流图，见图3及4。由图3可知，1号峰为空白峰。色谱结果查看及质谱解析由Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00解析软件操作完成并确定化合物[17-19]。扣除空白峰后以峰面积归一化法测定各组分的相对百分含量。对GC-MS图谱中的各峰进行质谱解析后与NIST14.L数据库匹配确定醋香附挥发性成分，结果见表4。从醋香附中共检出41个挥发性物质，可以反映醋香附样品中挥发性成分的总体特征。

图3 醋香附挥发性成分总离子流图Fig 3 Total ion current of volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

图4 空白对照的总离子流图Fig 4 Total ion current of the blank control

表4 醋香附挥发性成分表Tab 4 Volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

续表4

其中，相对含量＞1%的挥发性成分有醋酸、芹松香醇、环丙烯、lemnalol、脱氢芳烃、α-古巴烯、β-马来烯、莎草烯、罗丹烯、β-蛇床烯、环氧萜烯、氧化石竹烯、8-氧代-9H-环异长叶烯、香附烯酮、α-莎草酮，占总挥发性成分的87.01%，是醋香附主要挥发性成分。2号峰醋酸的发现也验证了本样品为香附的醋炙品。所有鉴定出的挥发性成分中氧化石竹烯、桉油精、古巴烯、莎草烯等成分在香附挥发油中也有检出[6，8-9，20]，但总体检出成分并不完全相同，可见提取方法与醋炙对香附的挥发性成分存在影响。HS-GC-MS法分析表明，醋香附挥发性成分中烯烃相对含量大于79.17%，含量最多，与徐黔江等[10]研究结论相符。

顶空进样法直接将样品密封于样品瓶中，经加热孵育可收集样品全部挥发性成分，不必担心加热过程中低沸点成分的损耗；样品经粉碎后可直接装样检测，节省时间，也不需要复杂的提取过程因此样品基质干扰极小；对于体积小、气味浓烈的样品具有无损检测的潜力。本研究还可以为醋香附与香附的气味对比研究和醋香附与其易混品的快速鉴别提供参考。