迷迭香精油在不同蒸馏时段的化学成分及抗氧化活性

周旭凯， 张 倩， 田玉红*， 陈房姣， 陆 苑

(1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学医学部，广西 柳州 545006)

迷迭香RosmarinusofficinalisL.属唇形科迷迭香属常绿灌木，具有提神醒脑、增强记忆力的功效，含有黄酮类、二萜酚类成分，可用作抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋病、治疗阿尔茨海默病药物的研发[1-6]。现代药理研究表明，迷迭香精油具有多种生物活性，因而被广泛应用于医药、食品和农药领域[7-12]。

精油是植物新陈代谢过程中形成的次生产物，常以“油”的状态存在于植物体内某些特殊器官，目前大多采用水蒸气蒸馏法[13]，但不同蒸馏时段精油的品质和化学组成有所不同[14]。目前，市面上有多种化学合成的抗氧化剂，但长期使用会对人体产生一定的潜在毒性，而植物精油毒性较低，可用于天然抗氧化剂的研发[15-17]。本实验采用水蒸气蒸馏法从迷迭香中提取精油，通过控制提取时间获得不同蒸馏时段迷迭香精油，对其化学组成和抗氧化活性进行考察，以期为该植物进一步开发利用提供参考。

1 材料

TRACE1300-ISQ QD气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5石英毛细色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)(美国Agilent公司)；1788挥发油提取器(湖州申玻仪器有限公司)；722S型可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)。2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、二胺盐自由基(ABTS+·)(瑞士Adamas公司)；过硫酸钾(K2S2O5)(汕头市西陇科学股份有限公司)；乙醇(C2H6O)(广东光华科技股份有限公司)；2，2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、维生素C(C6H8O6，维生素C)、丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)(美国Sigma公司)，以上试剂均为分析纯。迷迭香(干叶)购自玉林市诗舒原生中草药购销部(产地广西)，经广西壮族自治区玉林食品药品检验所专家鉴定为正品。

2 方法

2.1 精油提取 准确称取100 g药材，置于挥发油提取器中，加入2 000 mL蒸馏水，水蒸气蒸馏法提取0～10、10～30、30～60、60～360 min 4个蒸馏时段精油及0～360 min全蒸馏时段精油，冷却后读取体积，称定质量，计算提取率，公式为提取率=(不同蒸馏时段精油质量/药材质量)×100%，无水硫酸钠干燥后保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱中备用。

2.2 GC-MS分析条件

2.2.1 GC HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气高纯氦气；体积流量1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比1∶150；进样口温度280 ℃；接口温度280 ℃，程序升温(60 ℃保持5 min，2 ℃/min升至260 ℃，保持5 min)。

2.2.2 MS EI电离源；电子能量70 eV；电子倍增器电压1.5 kV；扫描范围m/z50～550；全扫描方式。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 对DPPH自由基(DPPH·)的清除能力 无水乙醇溶解DPPH·制得0.02 mg/mL溶液，避光保存。取不同质量浓度精油与DPPH·溶液各2 mL，充分混匀，确定反应时间为1 h，在517 nm波长处测定其吸光度Ai；以无水乙醇分别代替精油、DPPH·溶液，测定其吸光度Ac、Aj，重复3次，取平均值，以维生素C、BHA、TBHQ为阳性对照，计算DPPH·清除率，公式为清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

2.3.2 对ABTS自由基阳离子(ABTS+·)的清除能力 将7 mmol/L ABTS+·溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等比例混合，常温避光保存24 h后制得母液，无水乙醇调节其734 nm波长处吸光度至0.70±0.002，得到工作液。取不同质量浓度精油与ABTS+·工作液各2 mL，充分混匀，避光6 min后测定其吸光度Ai；以无水乙醇代替精油，测定其吸光度A0，重复3次，取平均值，以维生素C、BHA、TBHQ为阳性对照，计算ABTS+·清除率，公式为清除率=[(A0-Ai)/A0]×100%。

3 结果

3.1 精油提取率 在0～10、10～30、30～60、60～360 min，精油提取率分别为(1.09±0.04)%、(0.42±0.04)%、(0.29±0.01)%、(0.33±0.01)%，可知其出油速度较快，10 min内就提取了48.83%，而1 h内达78.70%。

3.2 GC-MS分析 在0～10 min鉴定了50种成分，占总峰面积的99.09%；10～30 min鉴定了48种成分，占总峰面积的98.99%；30～60 min鉴定了47种成分，占总峰面积的97.76%；60～360 min鉴定了59种成分，占总峰面积的90.28%；0～360 min鉴定了56种成分，占总峰面积的96.66%。结果见表1。

表1 不同蒸馏时段精油化学成分

由此可知，0～10 min精油中碳氢化合物26种，占总峰面积的24.61%；醇类成分9种，占总峰面积的12.56%；醚类成分2种，占总峰面积的38.49%；醛类成分1种，占总峰面积的0.11%；酮类成分5种，占总峰面积的22.45%；酯类成分1种，占总峰面积的0.70%；酚类4种，占总峰面积的0.11%；环氧化合物2种，占总峰面积的0.06%，其主要成分为桉叶油素(38.45%)、D-樟脑(22.31%)、α-蒎烯(12.03%)、莰烯(5.99%)。10～30 min精油中碳氢化合物45种，占总峰面积的13.99%；醇类成分8种，占总峰面积的20.59%；醚类成分3种，占总峰面积的34.66%；醛类成分1种，占总峰面积的0.16%；酮类成分5种，占总峰面积的28.07%；酯类成分1种，占总峰面积的0.99%；酚类4种，占总峰面积的0.33%；环氧化合物3种，占总峰面积的0.20%，其主要成分为桉叶油素(34.52%)、D-樟脑(27.83%)、冰片(8.35%)、α-松油醇(7.51%)。30～60 min精油中碳氢化合物22种，占总峰面积的19.79%；醇类成分8种，占总峰面积的25.54%；醚类成分3种，占总峰面积的24.80%；醛类成分1种，占总峰面积的0.22%；酮类成分5种，占总峰面积的24.79%；酯类成分1种，占总峰面积的1.32%；酚类4种，占总峰面积的0.80%；环氧化合物3种，占总峰面积的0.50%，其主要成分为桉叶油素(24.56%)、D-樟脑(24.52%)、α-松油醇(10.91%)、冰片(10.64%)。60～360 min精油中碳氢化合物31种，占总峰面积的39.85%；醇类成分11种，占总峰面积的20.22%；醚类成分3种，占总峰面积的14.06%；醛类成分1种，占总峰面积的0.15%；酮类成分5种，占总峰面积的9.89%；酯类成分1种，占总峰面积的1.47%；酚类4种，占总峰面积的2.48%；环氧化合物3种，占总峰面积的2.16%，其主要成分为桉叶油素(13.65%)、α-蒎烯(12.77%)、D-樟脑(9.14%)、α-松油醇(8.59%)。0～360 min精油中碳氢化合物29种，占总峰面积的23.44%；醇类成分9种，占总峰面积的15.78%；醚类成分3种，占总峰面积的34.23%；醛类成分1种，占总峰面积的0.13%；酮类成分6种，占总峰面积的21.00%；酯类成分1种，占总峰面积的0.96%；酚类4种，占总峰面积的0.65%；环氧化合物3种，占总峰面积的0.47%，其主要成分为桉叶油素(34.06%)、D-樟脑(20.72%)、α-蒎烯(10.83%)、冰片(6.44%)。4个蒸馏时段及全精油中含量最高的成分均为桉叶油素，并随着时间延长逐渐降低，该成分有樟脑气息和清凉的草药味道，具有杀菌、杀虫作用，大多用于医药和食品香料，还常用作防腐剂[18]。Verma等[19]采用气相色谱-火焰电离检测仪(GC-FID)和气相色谱-质谱技术(GC-MS)分析印度北部亚热带地区不同生长阶段(150、165、180、195、210、225 d)的迷迭香精油，发现不同生长阶段其主要成分相同，均为樟脑(23.9%～33.2%)、桉叶油素(20.4%～23.9%)、α-蒎烯(8.5%～14.4%)、马苄烯酮(6.9%～10.1%)，但其相对含量存在差异。Jardak等[20]使用GC-MS在突尼斯迷迭香精油中鉴定了36个化合物，主要为桉叶油素(23.56%)、莰烯(12.78%)、樟脑(12.55%)。前期报道，精油成分受植物产地气候、土壤、收获后制备方法、贮存时间等因素的影响[21]。

不同蒸馏时段精油成分主要为萜类，0～10 min其含量为97.50%，其中单萜烯12种，占总峰面积的22.11%；含氧单萜15种，占总峰面积的74.05%；倍半萜烯11种，占总峰面积的1.25%，含氧倍半萜3种，占总峰面积的0.09%。10～30 min其含量为97.05%，其中单萜烯13种，占总峰面积的12.32%；含氧单萜15种，占总峰面积的84.14%；倍半萜烯6种，占总峰面积的0.32%；含氧倍半萜4种，占总峰面积的0.27%。30～60 min其含量为93.46%，其中单萜烯13种，占总峰面积的15.94%；含氧单萜14种，占总峰面积的76.29%；倍半萜烯6种，占总峰面积的0.57%；含氧倍半萜4种，占总峰面积的0.65%。60～360 min其含量为79.70%，其中单萜烯15种，占总峰面积的27.18%；含氧单萜14种，占总峰面积的41.79%；倍半萜烯11种，占总峰面积的4.93%；含氧倍半萜8种，占总峰面积的5.65%。0～360 min其含量为93.96%，其中单萜烯14种，占总峰面积的19.99%；含氧单萜15种，占总峰面积的71.66%；倍半萜烯12种，占总峰面积的1.67%；含氧倍半萜5种，占总峰面积的0.62%。

同时还发现，在0～10、10～30、30～60 min单萜含量较高，而倍半萜含量较低；在60～360 min单萜含量明显降低，而倍半萜含量明显升高。田玉红等[22]报道，蒸馏初期赤桉叶油成分以单萜为主，之后倍半萜种类和含量逐渐升高。现有研究表明，挥发性萜是挥发油中生物活性较强或具有芳香性气味的主要成分，因其具有抗氧化、抗病毒、抗菌、杀虫等作用，被广泛应用于食品、化妆品、医药、保健、农药等领域[23-25]。

3.3 精油对DPPH·的清除作用 由图1、表2可知，随着精油质量浓度升高，对DPPH·的清除效果增强，即呈量效关系；在0～10、10～30、30～60、60～360 min的IC50值分别为20.78、14.29、5.27、2.23 mg/mL，即各蒸馏时段的清除效果依次为60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min。

表2 不同蒸馏时段精油的抗氧化活性

3.4 精油对ABTS+·的清除作用 由图2、表2可知，随着精油质量浓度升高，对ABTS+·的清除效果增强；在0～10、10～30、30～60、60～360、0～360 min的IC50值分别为2.43、1.40、0.49、0.20 mg/mL，即各蒸馏时段的清除效果依次为60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min。

4 讨论与结论

研究表明，酚类可能是植物精油具有抗氧化活性的主要物质[26-28]，其清除自由基的机理为酚(苯氧)自由基1个电子的还原电位显著低于氧自由基，两者发生反应，将后者氧化为苯氧基；苯氧基的反应性低于氧基，能直接清除有害的反应氧中间体，并将后者钝化而不会发生进一步的氧化反应[29]。本实验发现，迷迭香精油中0～10、10～30、30～60、60～360 min 4个蒸馏时段及0～360 min全蒸馏时段鉴定出来的酚类主要为麝香草酚、3-甲基-4-异丙基苯酚、香芹酚、丁香酚，总含量分别为0.11%、0.33%、0.80%、2.48%、0.65%，并且其数值越高，清除DPPH·、ABTS+·的能力越强。

本实验分别提取了0～10、10～30、30～60、60～360 min 4个蒸馏时段迷迭香精油，并采用GC-MS法对其成分进行分析，发现以萜类为主，在0～10、10～30、30～60 min时单萜含量较高，倍半萜类成分含量较低，而在60～360 min时后者含量明显升高；不同蒸馏时段迷迭香精油中含量最高的成分均为桉叶油醇，但其相对含量变化较大，分别为38.45%、34.52%、24.56%、13.65%。另外，不同蒸馏时段精油清除DPPH·、ABTS+·自由基的能力依次为60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min，表明酚类含量越高，清除DPPH·、ABTS+·的能力越强。