挤压膨化糙米香气物质的顶空固相微萃取条件优化

陈焱芳，张雁，邓媛元，魏振承，唐小俊，刘光，张名位

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州510610）

全谷物糙米中蛋白质、维生素、膳食纤维以及游离态的钙、铁、锌等重要矿物元素的含量均高于精白米。此外，糙米还富含许多精白米不含或含量很少的功能性营养因子，如γ-氨基丁酸、谷胱甘肽和谷维素等，这些功能性成分使糙米具有预防心脑血管疾病、降血糖、降血脂、改善新陈代谢和增强免疫力等一系列保健功效[1]。然而，糙米的糠层含有大量糠蜡和纤维等物质，直接食用不仅口感粗糙[2]、香气也十分清淡[3]，消费者接受程度并不高。

研究发现，香气物质对糙米的可接受性起着重要作用[4-5]。挤压膨化技术集混合、搅拌、破碎、加热、杀菌、膨化及成型等过程为一体[6]，物料在加工过程中会发生分解、降解、变性和交联作用以及氧化、聚合、水解等各种化学反应。挤压膨化处理可以提高糙米的适口性和风味，是糙米加工前景广阔的重要技术[7]。HE F等[8]研究发现糙米经挤压膨化处理后，2-乙酰基吡咯啉、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等化合物的风味稀释（flavor dilution，FD）因子显著升高，并认为这些化合物可能对挤压膨化糙米的香气有更大的贡献。

顶空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）技术具有操作简便、萃取速度快、选择性高等优点[9]。SPME吸附挥发性物质是一个动态平衡的过程，其吸附效果易受萃取温度和时间等条件的影响[10-11]。HS-SPME提取挥发性物质的报道主要集中于稻米[11-12]或煮熟米饭[13-16]，而有关糙米及挤压膨化糙米香气物质的提取却鲜有报道，或是报道的方法并未考虑提取的化合物是否具有气味活性[17-18]。实际上绝大多数挥发性物质对糙米香气几乎没有贡献[19]。本课题组前期用溶剂辅助风味蒸发技术与气质联用鉴定出糙米及挤压膨化糙米中的71种挥发性风味化合物[8]，本试验以其中16种经过气相色谱-嗅味（gas chromatography-olfactometry，GC-O）鉴定的具有香气的化合物作为分析指标，采用HS-SPME和气相色谱-质谱（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）对其萃取条件进行优化，以期为挤压膨化糙米中香气物质的进一步定量分析打下基础，有助于更好地在生产和贮藏过程中调控糙米及其加工产物的风味。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

五常长粒糙米：市售；C5～C25正构烷烃混标：上海安谱科学仪器有限公司；氦气（99.999%）：广州龙奥气体设备有限公司；氯化钠（分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取手动进样手柄（57330U）、固相微萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，57328U）：美国 Supelco公司；20 mm钳口100 mL透明顶空样品瓶：上海安谱科学仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪（7890B/5977B MSD）：美国 Agilent公司；色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm HP-5MS）：美国Agilent J&W公司；嗅闻仪（ODP3）：德国Gerstel公司；集热式恒温磁力搅拌浴（HWCL-5）：郑州长城科工贸有限公司；双螺杆膨化机（DS30-Ⅱ型）：山东赛信膨化机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 挤压膨化工艺参数

糙米水分含量调节为10%，挤压机前端、中端和末端温度分别60、98、134℃，螺杆转速29.6 Hz。挤出样品粉碎后过60目筛，冷却至室温（25℃）后样品含水量约为9%，所有样品用聚乙烯食品包装袋密封后保存于-18℃冷库中以备后续试验分析。

1.3.2 萃取方法

取3.0 g挤压膨化糙米粉，倒入体积100 mL顶空样品瓶中，加入21 mL饱和NaCl溶液，放入转子后钳紧瓶盖。顶空瓶立即放入恒温磁力搅拌浴中，平衡和萃取温度均为55℃，平衡20 min，然后插入SPME纤维头，顶空萃取45 min。萃取完毕后，将SPME纤维头插入GC-MS进样口，于250℃解吸5 min。

1.3.3 GC-MS参数条件及分析

色谱条件：HP-5MS 型（30 m×250 μm×0.25 μm）毛细管柱；载气为高纯氦气（99.999%）；恒流恒压模式，流量为 1.7 mL/min，压力为 13.3 Psi，分流比为 5∶1；进样口温度250℃；升温程序：初始温度40℃，保持5 min，以3℃/min升至185℃，保持 5 min，以5℃/min升至130℃，保持1 min，以15℃/min升至230℃，保持3 min，总运行时间约为45 min。

质谱条件：电子轰击离子源（electron impact，EI），电子能量70eV；传输线温度250℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度280℃；扫描质量范围35～400 m/z。

1.3.4 定性与定量分析

1）定性分析：未知挥发性化合物经计算机检索与NIST14标准质谱库匹配，选择匹配度大于80的化合物进行保留指数（retention index，RI）计算。于1.3.3所述条件下对C5～C25正构烷烃混标进行GC-MS分析，记录各正构烷烃保留时间，根据程序升温公式（式1）计算各化合物的RI，并与参考文献中的RI值进行对比，从而确定化合物的种类。

式中：tn和tn+1为碳原子数为n和n+1的正烷烃流出峰的保留时间，min；tx为被分析组分流出峰的保留时间，min，且 tn＜tx＜tn+1。

2）定量分析：采用峰面积归一化法对化合物进行定量。

1.3.5 单因素试验

根据预试验结果，选定样品量为3.0 g，对料液比[1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL）]，萃取温度（35、45、55、65、75 ℃），平衡时间（15、20、25、30、35 min）及吸附时间（35、40、45、50、55 min）做单因素试验，初步找到优化萃取条件。以16种气味活性化合物的离子色谱总峰面积来表征不同萃取条件的萃取效果，总峰面积越大表明萃取效果越好。

1.3.6 响应面分析

在单因素试验的基础上，运用响应面法优化HSSPME萃取挤压膨化糙米香气物质的条件，最终得到最优固相微萃取条件。通过单因素试验，确定了料液比、萃取温度、平衡时间及吸附时间4个单因素的优化条件。为确定各因素之间的最佳比例，根据Box-Behnken试验设计原理，选取若干因素进行响应面分析，以香气物质的离子色谱总峰面积作为响应指标。

1.3.7 数据处理

每个样品重复3次试验，各指标差异显著性分析采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并采用Duncan法进行多组样本间比较。数据处理及制图采用SPSS 20、Origin 9和Design Expert 8.0等软件进行。

2 结果与分析

2.1 定性分析

图1为挤压膨化糙米香气物质的GC-MS总离子流色谱图，序号1～16分别为16种气味活性化合物，其保留指数及气味描述见表1。试验以16种气味活性化合物的离子色谱总峰面积来表征不同萃取条件的萃取效果，总峰面积越大表明萃取效果越好。

为了验证试验GC-MS参数设置是否合理以及定性试验误差是否在可接受范围内，由文献RI参考值与试验RI值的拟合曲线对比图（图2）可以看出，图中y1为RI参考值拟合线方程，y2为RI试验值拟合线方程，RI参考值（R2=0.954 1）和 RI试验值（R2=0.952 3）具有很好的拟合性，且各保留时间下RI试验值与RI参考值相近，表明GC-MS参数设置合理，RI参考值与RI试验值之间具有高度相关性，定性试验误差小。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比的选择

选择料液比 1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL）进行单因素试验，得到挤压膨化糙米中香气物质离子色谱总峰面积如图3所示。

图1 香气物质的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of aroma compounds

表1 香气物质的保留指数及气味描述Table 1 Retention index and odor description of aroma compounds

图2 RI参考值与RI试验值拟合曲线比较Fig.2 Fitting line comparison between reference retention indices and experimental retention indices

图3 料液比与香气物质总峰面积之间的关系Fig.3 The relationship between the ratio of material to liquid and the total peak area of aroma compounds

由图3可知，当料液比为1∶3（g/mL）时，样品体系偏浓稠，平衡时搅拌不充分、水浴受热不均匀，香气物质不能很好地挥发出来；当料液比为1∶11（g/mL）时糙米粉稀释倍数较大，加之萃取温度不高，香气物质可能难以逸出溶液体系；料液比 1 ∶5、1∶7、1∶9（g/mL）时香气物质的离子色谱总峰面积分别为（312.95±2.80）×106、（315.69±2.78）×106、（309.65±3.80）×106，三者无显著性差异、萃取效果相当，但料液比为1∶7（g/mL）时峰面积更高且相对偏差更小，萃取效果更加稳定，因此选择料液比1∶7（g/mL）为最佳值。

2.2.2 萃取温度的选择

选择萃取温度 35、45、55、65、75 ℃进行单因素试验，测得萃取温度与香气物质的离子色谱总峰面积关系如图4所示。

图4 萃取温度与香气物质总峰面积之间的关系Fig.4 The relationship between the extraction temperature and the total peak area of aroma compounds

随着萃取温度升高，气体分子运动加快，有利于香气物质到达萃取纤维表面；但温度过高可能会导致更多无香气化合物的产生与吸附、不稳定香气物质的吸附减少、萃取纤维吸附能力降低等情况的发生，从而影响吸附效果[11]。从图4可以看出，萃取温度对萃取效果影响显著，当萃取温度为55℃时，香气物质总峰面积最大，因此取萃取温度55℃为最佳值。

2.2.3 平衡时间的选择

选择平衡时间 15、20、25、30、35 min 进行单因素试验，测得平衡时间与香气物质的离子色谱总峰面积关系如图5所示。平衡时间的长短影响样品体系挥发性成分的动态平衡，进而影响萃取纤维的吸附量和达到吸附饱和的时间。

图5 平衡时间与香气物质总峰面积之间的关系Fig.5 The relationship between the equilibrium time and the total peak area of aroma compounds

从图5可以看出，香气物质的总峰面积随着平衡时间的延长而增大，在20 min时达到吸附饱和，香气物质总峰面积为（315.69±2.78）×106，25、30min 时香气物质总峰面积分别为（311.49±2.04）×106、（307.45±2.08）×106。平衡时间为20、25、30 min时香气物质总峰面积无显著性差异，但平衡20 min后香气物质总峰面积呈缓慢下降趋势，由此推测平衡时间20 min为最佳值。

2.2.4 吸附时间的选择

选择吸附时间 35、40、45、50、55 min 进行单因素试验，测得吸附时间与香气物质的离子色谱总峰面积关系如图6所示。

图6 吸附时间与香气物质总峰面积之间的关系Fig.6 The relationship between the adsorption time and the total peak area of aroma compounds

由图6可知，吸附时间不足45 min时，随着吸附时间的延长，萃取纤维吸附的香气物质逐渐增多；45 min时香气物质的总峰面积达到最大为（315.69±2.78）×106，而吸附时间超过45 min后总峰面积不断减小，这可能是由于萃取纤维在吸附饱和的情况下，受热吸附时间过长导致热稳定性低的香气物质分解和吸附到更多无香气化合物所致，因此取吸附时间45 min为最佳值。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面因素的确定及试验方案

根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素试验结果，选择50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，样品质量 3.0 g；料液比 1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9（g/mL）对萃取效果影响无显著性差异，但料液比1∶7（g/mL）时香气物质的总峰面积更高且相对偏差更小，因此固定料液比为1∶7（g/mL）。选取萃取温度（A）、平衡时间（B）、吸附时间（C）为自变量，以固相微萃取的香气物质的离子色谱总峰面积作为响应指标（Y），进行三因素三水平响应面分析试验，试验因素与水平见表2。

表2 Box-Behnken试验因素及水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2.3.2 试验设计及回归分析

以香气物质离子色谱总峰面积为响应值进行响应面分析，试验设计为交叉试验12个，零点试验5个。试验设计及结果见表3，回归分析结果见表4。

表3 Box-Behnken设计方案及试验结果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

表4 响应面回归模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

根据试验结果，使用Design-Expert 8.0对表3中数据进行多元回归拟合，得到挤压膨化糙米中香气物质的离子色谱总峰面积（Y）对萃取温度（A）、平衡时间（B）、吸附时间（C）的二次回归方程模型为：Y=3.165×108-9.963×106A-7.229×105B-7.747×106C-8.116×106AB-3.931×105AC＋1.409×107BC-1.254×107A2-1.624×107B2-1.923×107C2

回归模型整体为高度显著（p=0.000 1＜0.001），回归模型的失拟项不显著（p=0.576 1＞0.05），说明该模型拟合度好，是可信的，可以用此模型检验使用HSSPME提取挤压膨化糙米中香气物质的效果，探究因素的最优响应水平。通过软件分析该回归模型，R2=0.978 1，R2Adj=0.949 8，说明相应指标的变化有94.98%来源于优化的因素即萃取温度、平衡时间和吸附时间，回归方程与实际值具有很高的拟合性，因此回归方程可以代替真实值解释响应指标的结果。

由表4可知，所选因素中萃取温度A对萃取效果高度显著，吸附时间对萃取效果极显著，萃取温度A2、平衡时间B2、吸附时间C2的二次项对萃取效果高度显著，两两因素交互，即萃取温度与平衡时间AB、平衡时间与吸附时间BC对萃取效果影响极显著或高度显著，说明了萃取温度以及吸附时间对香气物质固相微萃取效果影响显著，而平衡时间、交互项萃取温度与吸附时间对固相微萃取效果影响不显著，说明这些条件对香气物质提取效果的影响并不是简单的线性关系。

2.3.3 响应面曲面分析

通过Design-Expert 8.0得出响应面的立体图如图7～图9所示，可以直观的看出各因素对响应指标的影响，以及最优和最佳因素水平。

图7 萃取温度和平衡时间对总峰面积影响的响应曲面及等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the influence of extraction temperature and equilibrium time on the total peak area

图8 萃取温度和吸附时间对总峰面积影响的响应曲面及等高线图Fig.8 Response surface and contour map of the influence of extraction temperature and adsorption time on the total peak area

图9 吸附时间和平衡时间对总峰面积影响的响应曲面及等高线图Fig.9 Response surface and contour map of the influence of adsorption time and equilibrium time on the total peak area

图7是吸附时间为45 min时，萃取温度和平衡时间对香气物质的离子色谱总峰面积影响的响应曲面，随着萃取温度的升高，总峰面积先增加后迅速减少；随着平衡时间的延长，总峰面积先增后减的趋势相对较为平缓。图8是萃取温度和吸附时间对总峰面积交互影响的响应曲面，随着萃取温度的升高或平衡时间的延长，总峰面积均有明显先增后减的变化趋势。图9是平衡时间和吸附时间对总峰面积交互影响的响应曲面，随着平衡时间的延长，总峰面积先增后减、且减少段变化趋势更加明显；随着吸附时间的延长，总峰面积同样先增后减、但增加段变化趋势更加明显。与表4中得出的方差分析结果相似，从响应曲面图可以看出对香气物质离子色谱总峰面积影响最大的因素是萃取温度，其次是吸附时间，然后是平衡时间。

根据Design-Expert 8.0中最大值优化法，在模型范围中选择最高点为出发点，优化得到HS-SPME提取香气物质的最优条件为萃取温度51.11℃，平衡时间19.94 min，吸附时间43.99 min，预测该条件下测得香气物质的总峰面积为3.190×108。考虑到实际情况，进行略微调整后的最优萃取条件为：样品量3.0 g，料液比 1∶7（g/mL），萃取温度 51℃，平衡时间 20 min，吸附时间44 min。采用上述条件做验证试验，萃取的香气物质的离子色谱总峰面积为3.215×108，相对误差为0.78%、与预测值相差较小；同时单因素试验得到的香气物质的总峰面积最大值为3.157×108，小于最优萃取条件下得到的数值，说明该模型优化所得的萃取条件的参数可信度高，且优化萃取条件是更加合理可行的。

3 结论

本试验以16种香气物质的总峰面积为优化指标，更加符合研究糙米挥发性风味化合物的实际意义。首先对萃取条件中的料液比、萃取温度、平衡时间及吸附时间做单因素试验，在初步得到优化条件的基础上，对萃取温度（45、55、65 ℃）、平衡时间（15、20、25 min）和吸附时间（40、45、50 min）做三因素三水平的响应面分析。响应面二次回归方程模型整体为高度显著，拟合度好、可信度高。所选因素中萃取温度、交互项的平衡时间与吸附时间对萃取效果影响高度显著，吸附时间、交互项的萃取温度与平衡时间对萃取效果影响极显著，而平衡时间以及交互项的萃取温度与吸附时间对萃取效果影响不显著，说明这些条件对香气物质提取效果的影响并不是简单的线性关系。

最终得到的挤压膨化糙米HS-SPME最佳条件为样品量 3.0 g，料液比 1∶7（g/mL），萃取温度 51℃，平衡时间20 min，吸附时间44 min。验证试验中得到的香气物质的离子色谱总峰面积为3.215×108，与预测值（3.190×108）的相对误差为0.78%，说明该模型优化所得的萃取条件参数是合理可行的，具有实用价值，有利于挤压膨化糙米中香气物质的进一步定性、定量分析。