基于UPLC-Q-TOF-MS法的郁金水提物的化学成分研究

张尚霞，王宇红*，龙红萍，刘检，赵洪庆，凌佳，牟晴蕊（1.湖南中医药大学，长沙410208；2.湖南中医药大学科技创新中心，长沙 410208；.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007）

郁金（Curcumae Radix）是姜科植物中广西莪术、蓬莪术、温郁金、姜黄的干燥块根，郁金性苦寒，是活血化瘀的药物，主要作用为理气解郁、保肝利胆、祛瘀止血等，用于治疗胸痹心痛、经闭痛经、胸胁刺痛等临床症状[1]。现代药理研究表明郁金具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、保肝、抗氧化、抗血栓等作用[2-3]，因此有必要对其化学成分进行全面研究。目前对郁金化学成分的研究多采用传统的提取分离鉴定，存在周期长、效率低的问题，亟需建立一个多成分快速分析、能提供尽可能丰富可靠数据的方法。

液质联用技术拥有色谱的高分离性能和质谱高灵敏度的特点[4-5]，为中药的质量控制和资源合理利用奠定了基础，已被广泛用于天然药物的分析，极大地推动了中药研究的发展。本文使用UPLC-Q-TOF-MS法，并结合中药成分信息数据库及相关文献[6-7]，探讨郁金的化学成分，为郁金的药效物质基础和质量控制提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

MassHunter质谱工作站、Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF超高效液相-四级杆-飞行时间质谱、Qualitative Analysis B.08.00数据处理软件（美国Agilent公司）；Metler Toledo PL402-L电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）；SK-7200HP超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Eppendorf Centrifuge5424 R离心机（德国艾本德公司）。

1.2 试药

质谱级甲酸、质谱级乙腈、色谱级甲醇（Merck公司）；蒸馏水（深圳屈臣氏蒸馏水有限公司）。温郁金（湖南衡岳中药饮片有限公司，产地：广东，批号：190301，经湖南中医药大学第一附属医院药学部张志国教授鉴定为姜科植物温郁金的干燥块茎）。莪术醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100185-201908，纯度：99.1%）。

2 方法

2.1 供试品溶液的配制

称取郁金药材50 g，加入1000 mL圆底烧瓶中，并加入10倍量超纯水后，加热煮沸，冷凝管回流煮沸1.5 h，冷却，三层纱布过滤，继续加8倍量超纯水，加热煮沸，冷凝回流煮沸1 h，冷却，三层纱布过滤，合并两次水提药液，旋转蒸发仪浓缩后真空干燥箱干燥。精密称取干燥后的浸膏0.2000 g，加入甲醇5 mL，超声30 min充分溶解，3000 r·min－1离心5 min，取上清液置于1.5 mL离心管中，12 000 r·min－1离心5 min，取上清液混匀后微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取对照品2.0 mg，置于10 mL量瓶，加70%的甲醇超声溶解，定容成200 μg·mL－1的工作液母液，质谱检测时70%甲醇稀释10倍，微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；正离子模式时，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），负离子模式时，流动相为乙腈（A）-5 mmol·L－1乙酸铵水（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～15%A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～70%A；30～40 min，70%～95%A），流速为0.4 mL·min－1，进样量为2 μL。

2.4 质谱条件

应用电喷雾正、负离子模式进行检测，扫描方式为MRE扫描，使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-8500）对准确质量数进行矫正。一级全扫质量扫描范围为m/z100～1500，分辨率为30 000，除溶剂气体为氮气；干燥气流速为6.8 L·min－1；干燥气温度为325℃；毛细管电压为4.0 kV；Fragment电压为110 V；鞘气温度为350℃；二级质谱使用依赖性扫描，在一级扫描基础之上选择前三强进行诱导碰撞解离（CID）获取其二级质谱数据。

2.5 数据处理

根据Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站的特点，设置有效的阈值参数，对郁金水提物正负离子模式下采集的数据进行分析，检索化学成分的准离子分子峰的信息，依据供试品质谱准分子离子峰、碎片离子、色谱保留时间，结合中药系统药理学数据库与分析平台（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]和中药综合数据库（http：//www.megabionet.org/tcmid/）[7]，参照化合物的对照品图谱及电子期刊数据库PubMed、CNKI，对郁金的化学成分的名称、CAS号、分子式、相对分子质量等信息进行分析。

3 结果与分析

3.1 郁金水提物质谱色谱峰的分析

郁金水提物正、负离子流图如图1所示。对郁金水提物正、负离子流图进行分析，结果共从郁金水提物中鉴定出52种已知化学成分，1种成分未知，化学成分的质谱色谱信息如表1所示。

图1 郁金水提物UPLC-Q-TOF-MS总离子流色谱图Fig 1 TIC of water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS

表1 郁金水提物化学成分质谱信息Tab 1 Chemical constituents in water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS

续表1

3.2 郁金化学成分裂解规律分析

采用液质联用技术分析郁金二级质谱，以化学成分4、11、27、39、51为例，分析郁金化学成分裂解规律，结果如下：

化学成分4（tR＝3.226 min）在正离子模式下m/z149.0591 [M＋H]＋，二级质谱中碎片离子峰m/z103，与化学成分总离子峰相差46，推测可能是化学成分失去了1个CO2分子后的离子碎片，分析该化学成分的质谱裂解过程与其他文献相一致[15]，并参考该化学成分的色谱保留时间、质谱总离子峰、裂解碎片等信息，因此，该化学成分被鉴定为肉桂酸，其裂解过程如图2A。

化学成分11（tR＝14.51 min）在正离子模式下m/z253.1805 [M＋H]＋，二级质谱中主要碎片离子峰m/z235，与化学成分总离子峰相差18，推测可能是化学成分失去了1个H2O分子后的离子碎片，并参考该化学成分的色谱保留时间、总离子峰、裂解碎片等信息，鉴定其为郁金二醇。

化学成分27（tR＝23.518 min）在正离子模式下m/z265.1457 [M＋H]＋，二级质谱中主要碎片离子峰m/z247，与化学成分总离子峰相差18，推测可能是化学成分失去了1个H2O分子后的离子碎片，在负离子模式下m/z263.1274 [M-H]－，二级质谱中主要碎片离子峰m/z245，与化学成分总离子峰相差18，推测可能是化学成分失去了1个H2O分子后的离子碎片，并参考该化学成分的色谱保留时间、总离子峰、裂解碎片等信息，该化学成分鉴定为反，反-1，7-二苯基-1，3-庚二烯-3-酮。

化学成分39（tR＝27.266 min）在正离子模式下m/z237.1844 [M＋H]＋，二级质谱中碎片离子峰m/z219，201，与文献报道的莪术醇质谱裂解过程相一致[16]。通过推测，碎片离子峰m/z219与化学成分总离子峰相差18，推断可能是化学成分失去了1个H2O分子后的离子碎片，碎片离子峰m/z201与碎片离子峰m/z219相差18，推断是碎片离子失去了1个H2O分子后的离子碎片，参考该化学成分的色谱保留时间、质谱总离子峰、裂解碎片等信息，并与该化学成分的对照品相比较，该化学成分被鉴定为莪术醇，其裂解过程如图2B。

图2 郁金化学成分肉桂酸（A）、莪术醇（B）可能的裂解途径Fig 2 Proposed fragmentation pathway of cinnamic acid（A），and curcumol（B）

化学成分51（tR＝33.844 min）在正离子模式下m/z217.1587 [M＋H]＋，二级质谱中碎片离子峰m/z201，与化学成分总离子峰相差15，推断可能是化学成分失去了1个甲基化学基团后的离子碎片，分析该化学成分的质谱裂解过程与其他文献相一致[17]，参考该化学成分的色谱保留时间、质谱总离子峰、裂解碎片等信息，该化学成分被鉴定为芳姜黄酮。

3.3 郁金水提物化学成分

将UPLC-Q-TOF-MS法分析获得的52种郁金水提物化学成分进行分类，可分为34种倍半萜类、4种二萜类、2种三萜类、4种姜黄素类、2种有机酸类和6种其他类化合物。

3.3.1 倍半萜类化合物 倍半萜类化合物是指分子中含15个碳原子并含有3个异戊二烯单元的天然萜类化合物，具有链状、环状等多种骨架结构。本研究从郁金水提物中鉴定出34种倍半萜类化合物，分别为：zedoarolide B（5）、zedoalactone A（6）、zedoalactone B（8）、curcumenolactone C（9）、郁金二醇（11）、zedoalactone C（12）、异莪术烯醇（14）、欧亚活血丹内酯（15）、异郁金二醇（16）、呋喃大牻牛儿酮（17）、香豆酚（18）、表莪术酮（19）、zedoarol（21）、aerugidiol（22）、polydactin B（24）、异原莪术烯醇（25）、郁金烯酮（28）、呋喃二烯（29）、莪术烯（31）、（1S，4S，5S，10R）-zedoarondiol（32）、二氢莪术二酮（33）、呋喃二烯酮（34）、石竹烯氧化物（35）、curdionolide B（37）、gajutsulactone A（38）、莪术醇（39）、4-epi-curcumenol（40）、costunolide（41）、zederone（42）、curcumenol（43）、codonolactone（44）、β-cuparenone（45）、8-hydroxycadalene（48）和桂莪术内酯（50）。其化学结构如图3所示。

图3 郁金水提物的倍半萜类化学结构图Fig 3 Chemical structure of sesquiterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.2 二萜类化合物 二萜类化合物是由4个异戊二烯单位构成，含20个碳原子的化合物类群，结构显示多样性。本研究从郁金水提物中鉴定出4种二萜类化合物，分别为：curcuminol C（7）、curcuminol D（46）、curcuminol A（49）和curcuminol B（52）。其化学结构如图4所示。

图4 郁金水提物的二萜类化学结构图Fig 4 Chemical structure of diterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.3 三萜类化合物 三萜类化合物是由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质，大部分含30个碳原子，少部分含27个碳原子的萜类化合物，在自然界分布广泛。本研究从郁金水提物中鉴定出2种三萜类化合物，分别为促黄素Ⅱ（26）和二呋喃莪术烯酮（47）。其化学结构如图5所示。

图5 郁金水提物的三萜类化学结构图Fig 5 Chemical structure of triterpenoids in water extract of Curcumae Radix

3.3.4 姜黄素类化合物 姜黄素类化合物按化学结构特征分为单氧代型、双氧代型、三氧代型、吡喃取代型、呋喃取代型、大环醚型、二聚体型等7个类型，对人体无毒，具有潜在的临床应用价值。本研究从郁金水提物中鉴定出4种姜黄素类化合物，分别为二氢姜黄素（23）、姜黄醇酮（30）、甜没药姜黄醇（36）和芳姜黄酮（51）。其化学结构如图6所示。

图6 郁金水提物的姜黄素类化学结构图Fig 6 Chemical structure of curcumin in water extract of Curcumae Radix

3.3.5 有机酸类化合物 有机酸类化合物是指一些具有酸性的有机化合物，最常见的有机酸是羧酸，这些化合物中的一部分能够参与动植物代谢进程。本研究从郁金水提物中共鉴定出2种有机酸类化合物，分别为焦谷氨酸（1）和肉桂酸（4）。其化学结构如图7所示。

图7 郁金水提物的有机酸类化学结构图Fig 7 Chemical structure of organic acids in water extract of Curcumae Radix

3.3.6 其他类化合物 本研究从郁金水提物中鉴定出6种其他类化合物，分别为heterodendrin（2）、酪胺（3）、（E）-1，7-diphenyl-3-hydroxy-1-hepten-5-one（10）、反-1，7-二苯基-1-庚烯-5-醇（13）、反，反-1，7-二苯基-1，3-庚二烯-3-酮（27）和枯茗醛（53）。其化学结构如图8所示。

4 讨论

目前，文献报道对郁金成分的研究多采用醇提法[18]，或采用超临界流体萃取分离后，用气相色谱-质谱法分析[19]，或采用固相微萃取后，经过气相色谱和质谱进行分析[20]，或用水蒸气蒸馏法提取挥发油后，用GC-MS分析[21]，一般倾向于检测挥发类成分，无法系统阐释郁金的中等极性及大极性成分，缺乏对郁金成分的系统而全面的研究。本研究采用水提法提取郁金中的化学成分，可以进一步探讨郁金的中等极性及大极性成分，同时研究表明郁金水提物的化学成分可能具有抗抑郁、抗血栓、改善学习记忆能力等作用[22-24]。钱海兵等[22]研究表明郁金水提物对抑郁症大鼠的奖赏行为、自发性探索行为均有一定的疗效，且对抑郁症大鼠海马区的血管新生有一定的作用；宿玉等[23]研究表明桂郁金水提物可以调节前列环素（PGI2）和血栓素A2（TXA2）之间的相对稳定，主要通过增加内皮细胞中PGI2的分泌，降低TXA2的合成，抑制血小板聚集并起到抗血栓的作用；李纪彤等[24]研究表明温郁金水提物可以改善Aβ25-35引起的小鼠阿尔茨海默病的学习记忆能力。因此，本文对郁金水提物的成分进行分析，旨在全面系统地分析郁金的有效物质基础。

本研究选择UPLC-Q-TOF-MS法探讨郁金水提物中的化学成分，从郁金水提物中鉴定出52种化学成分，包括34种倍半萜类、4种二萜类、2种三萜类、4种姜黄素类、2种有机酸类和6种其他类化合物，为郁金临床应用提供了理论依据。