阿司匹林与氯吡格雷代谢相关基因多态性现状分析及对缺血性脑卒中复发的影响

钱凤丹，高岸，汪硕闻，周佳纯，李琴，范国荣（上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 200080）

目前，脑卒中已成为全球范围内第二大死亡原因[1]，而缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占70%[2]。在首次发生IS后，及时给予抗血小板药物作为二级预防，可减少缺血性脑卒中的复发，降低致残率和致死率。阿司匹林、氯吡格雷作为IS急性期治疗及二级预防的抗血小板药物，已被临床广泛推荐使用[3-5]。然而，由于个体差异，不同人群对抗血小板药物的敏感性不同，即使规范地使用抗血小板药物治疗，临床上每年仍有不少卒中再发事件。患者药物基因代谢的位点发生杂合或纯合突变可能引起药物敏感性降低，即发生阿司匹林抵抗或氯吡格雷抵抗，从而引起药效下降，抗血小板聚集不充分，导致缺血性事件发生[6-7]。本研究同时分析IS患者中阿司匹林和氯吡格雷两药多个基因位点多态性分布的特点，并随访患者一年内IS的复发情况，以期为IS二级预防的精准用药提供参考。

1 仪器与试药

TL988A型荧光检测仪（西安天隆科技有限公司）。核酸纯化试剂[商品名：耀金保，主要成分：60%聚乙二醇200（PEG200）、20 mmol·L－1KOH 和去离子水]；第一类体外诊断试剂、测序反应通用试剂盒（北京华夏时代基因科技发展有限公司）。TL988A型荧光检测仪（西安天隆科技有限公司）。

2 方法

2.1 研究对象

本研究共纳入2017年3月至2019年3月在本院神经内科住院，确诊为IS的300名患者，行阿司匹林和氯吡格雷代谢相关位点的基因检测。纳入标准：随机选取2017年3月至2019年3月，在上海市第一人民医院神经内科住院，经颅脑核磁共振成像（MRI）确诊为IS，年龄＞18岁，长期接受阿司匹林和/或氯吡格雷抗血小板治疗（≥1年），并同时行阿司匹林和氯吡格雷代谢相关基因检测的病例。排除标准：心源型缺血性脑卒中、脑出血史、动脉瘤、脑血管畸形等先天性疾病、急性消化道溃疡或消化道出血病史可能无法坚持长期服用抗血小板药物、有其他抗血小板治疗禁忌证、未同时检测阿司匹林和氯吡格雷代谢相关基因位点的患者，以及用药依从性较差的患者。

2.2 基因分型

采集患者外周静脉血血标本 2～3 mL，置于乙二胺四乙酸二钠抗凝真空管中，按测序反应通用试剂盒采用荧光染色原位杂交分析技术进行基因型检测。放入荧光检测仪中进行检测；由荧光染色原位杂交分析系统自动判读对应的荧光信号值，得到荧光曲线图，进行基因分型，同时作阳性质控。

2.3 统计分析

计量资料采用IBM SPSS 24.0软件进行各项数据统计分析。计算入组对象每个基因位点等位基因百分比，对研究对象Hardy-Weinberg遗传平衡（H-W平衡）[8]的符合程度进行χ2检验，P＞0.05代表入组的样本符合遗传平衡；P＜0.05时，说明样本发生偏倚，需剔除。

组间差异采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。使用IBM SPSS Statistics 24软件进行统计，分析终点事件IS复发与患者临床特征的相关性。单因素分析和多因素分析均使用SPSS的Binary Logistic回归；多因素分析通过建立Logit概率方程式，分析与IS复发的影响因素。

2.4 患者随访

患者出院时，根据医师是否采纳阿司匹林和氯吡格雷基因检测结果选择药物治疗方案，分为采纳建议组和未采纳建议组。

采纳建议组的用药情况包括：① 阿司匹林和氯吡格雷基因检测结果显示无基因突变或等位基因缺失者，随机选择阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次单药治疗；② 阿司匹林基因检测结果提示基因突变或等位基因缺失，氯吡格雷未突变者，选择氯吡格雷75 mg，每日一次单药治疗；③ 氯吡格雷基因检测结果提示基因突变或等位基因缺失，阿司匹林未突变者，选择阿司匹林100 mg，每日一次单药治疗；④ 阿司匹林和氯吡格雷基因检测结果显示均存在基因突变或等位基因缺失者，更换为西洛他唑50 mg，每日两次治疗。

未采纳建议组的用药情况：医师不参考基因检测结果，随机为患者选择阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次单药治疗。

随访指标即主要终点事件：由MRI明确诊断为新发IS或者短暂性脑缺血复发；次要终点事件为死亡，随访期为1年。

3 结果

3.1 患者的基本临床特征

入组的300名IS患者中基本临床特征见表1。可见上海地区IS男性发病率高于女性；＞60岁的发病率高于60岁以下人群；体质指数（BMI）≥24的占44.33%，即BMI偏高发生IS的风险较高；合并高血压的231例（77%）、糖尿病109例（36.33%）、总胆固醇（CH）大于上限的33例（11%）、三酰甘油（TG）大于上限的108例（36%）、低密度脂蛋白（LDL）大于上限的87例（29%）、高密度脂蛋白（HDL）低于下限的144例（48%）、脂蛋白a[Lpo（a）]大于上限的89例（29.67%）、高同型半胱氨酸血症（HCY）99例（33%）、低叶酸水平153例（51%）、颈动脉狭窄195例（65%）。

表1 300例缺血性脑卒中患者的基本临床特征Tab 1 Clinical data of 300 patiants with ischemic stroke

3.2 符合H-W平衡的阿司匹林和氯吡格雷相关基因代谢位点基因分布

根据H-W平衡检验结果，PEAR1、PTGS1、GP1BA的P＞0.05，说明群体基因遗传平衡。GPIIIaP1A2的P＜0.05，可能与近交、种群结构、基因分型有关联性，不符合H-W平衡，需剔除。由表2可见，上海地区IS患者PEAR1的GG型为121例（40.33%），GA型129例（43.00%）；PTGS1的GG型为299例（占99.67%）。GP1BA的CC型为264例（占88.00%）。

表2 符合H-W平衡检验的阿司匹林相关基因代谢位点基因型和等位基因分布Tab 2 Genotype and allele distribution of aspirin-related gene metabolism loci in line with H-W test

根据H-W平衡检验结果，CYP2C19*2、CYP2C19*3的P＞0.05，说明群体基因遗传平衡。CYP2C19*17的P＜0.05，可能与近交、种群结构、基因分型有关联性，不符合H-W平衡，需剔除。由表3可见，上海地区IS患者CYP2C19*2的GG型为127例（占42.33%），GA型137例（占45.67%）；CYP2C19*3的GG型为268例（占89.33%）。

表3 符合H-W检验的氯吡格雷相关基因代谢位点基因型和等位基因分布Tab 3 Genotype and allele distribution of clopidogrel-related gene metabolism loci in line with H-W test

3.3 阿司匹林和氯吡格雷基因代谢位点基因型分布和等位基因分布的比较

由表4和表5可见，PTGS1与IS患者的基本临床特征无相关性（P＞0.05）。PEAR1、GP1BA的基因和等位基因的分布频率与性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病、叶酸水平及血管狭窄情况无相关性（P＞0.05）。但PEAR1的基因型在CH＞5.2 mmol·L－1的患者中分布有差异（P＜0.05）；等位基因Lpo（a）＞300 mg·L－1，HCY＞15 μmol·L－1的IS患者中分布有显著差异（P＜0.05）。GP1BA的基因型在饮酒、CH＞5.2 mmol·L－1、LDL＞2.8 mmol·L－1的患者中分布有差异（P＜0.05）；等位基因在饮酒的IS患者中分布有差异（P＜0.05）。

表4 不同临床特征的300例缺血性脑卒中患者阿司匹林代谢相关基因位点基因型分布的比较[n(%)]Tab 4 Genotype distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [(n(%)]

表5 不同临床特征的300例缺血性脑卒中患者阿司匹林代谢相关基因位点等位基因分布的比较[n(%)]Tab 5 Alleles distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

由表6和表7可见，CYP2C19*2的基因型在伴有高脂血症的IS患者中的分布有显著差异（P＜0.05），等位基因分布频率无相关性，与其余基础临床特征和伴发疾病均无相关性（P＞0.05）。CYP2C19*3的基因型分布在有脑卒中家族史、等位基因分布频率在叶酸＜5.38 ng·mL－1的IS患者中有差异（P＜0.05），与其余基础临床特征和伴发疾病均无相关性（P＞0.05）。

表6 不同临床特征的300例缺血性脑卒中患者氯吡格雷代谢相关基因位点基因型分布的比较[n(%)]Tab 6 Genotype distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

表7 不同临床特征的300例缺血性脑卒中患者氯吡格雷代谢相关基因位点等位基因分布的比较[n(%)]Tab 7 Allele distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

3.4 随访结果

患者出院后，二级预防用药采纳建议组177例，未采纳建议组123例。由表8可知，采纳建议组IS复发率显著低于未采纳建议组（14.12%vs32.52%，P＜0.001）。

表8 采纳建议组与未采纳建议组缺血性脑卒中复发的比较Tab 8 Recurrence of ischemic stroke patients between the adoption group and the non-adoption group

3.5 Logistic回归分析

3.5.1 单因素分析 对组内25项变量进行Logistic回归分析，初始变量结果见表9。300例IS患者中，单因素分析结果显示是否采纳基因检测结果用药、有无饮酒和有无糖尿病与IS的复发显著相关。

表9 多元逐步回归单因素分析Tab 9 Multiple stepwise regression analysis of single factors

3.5.2 多因素分析 多因素分析使用似然比检验逐步法的Logistic回归拟合，得到方程为：Logit（P）＝ －1.059－1.010×采纳＋0.702×糖尿病，由表10可知，300例IS患者中，是否采纳基因检测结果用药和有无糖尿病与IS复发相关，根据比值比即OR（odds ratio）值，小于1的是保护因素，大于1是危险因素，所以未采纳基因检测结果用药、有糖尿病是IS复发的危险因素。

表10 多元逐步回归多因素分析Tab 10 Multiple factor stepwise regression analysis

4 讨论

本研究对象为上海地区的IS患者，男性发病率是女性的2.53倍，发病高峰年龄为61～70岁。有77%的患者合并高血压，36.33%的患者合并糖尿病，33%的患者合并高型半胱氨酸血症，51%的患者叶酸水平低于正常值，65%的患者有颈动脉狭窄。

药物基因多态性引起的个体化差异直接影响临床的治疗效果，如抗血小板不充分，IS复发。在美国每年约795 000例脑卒中患者中，有185 000例反复发作的，其中1/3到1/2的缺血性事件复发发生在抗血小板治疗期间[9]。

国内外已有较多围绕心脑血管疾病二级预防用药的单一药物的某个基因位点的多态性的相关研究[10-11]。而综合阿司匹林和氯吡格雷两种药物、多个位点基因多态性检测结果，选择二级预防用药的疗效相关研究较少。

本研究中IS人群的PEAR1、PTGS1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3位点符合H-W平衡，基本能反映其在上海地区IS患者中的多态性分布。并发现，PEAR1的GG型和GA型分别占40.33%和43.00%，携带A等位基因的有179例，服用阿司匹林后更易发生血小板聚集[12]，抵抗风险增加；PTGS1的GG型占99.67%，阿司匹林抵抗风险较GA型和AA型增加；GP1BA的CC型占88.00%，阿司匹林抵抗风险较CT型和TT型增加，与杨秀峰等[13]的研究一致。

CYP2C19*2的GA型占45.67%，对CYP2C19的代谢表型起主要决定作用。有研究报道中国人群CYP2C19*2，*3的突变率远高于欧洲、美洲国家和其他种族人群，与韩国和日本相近[14]。与白种人和非裔美国人人群相比，亚洲人的CYP2C19*2等位基因频率显着增高（13%vs18%vs30%）[15]，而CYP2C19*3的突变在亚洲人群中相较其他人群中的出现概率更高（10%vs＜1%）[16-17]。

根 据PEAR1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型与等位基因的分布特点分析，血脂代谢异常的IS患者，其代谢水平可能与PEAR1和GP1BA的基因分型有关；HCY代谢水平可能与PEAR1的基因分型有关；饮酒的习惯可能与GP1BA的基因分型有关。伴有高脂血症IS患者，其血脂代谢水平可能与CYP2C19*2的基因分型有关；而脑卒中家族史和患者的叶酸水平可能与CYP2C19*3的基因分型有关。因此，缺血性脑卒中患者，尤其有家族史的，在二级预防用药的同时，需要保持良好的生活习惯，包括保持运动、均衡膳食，控制血脂水平，多食绿色蔬菜，适当补充叶酸。

本研究300例IS患者，在出院后规律服用阿司匹林或氯吡格雷作为二级预防用药，采纳基因检测结果用药组缺血性脑卒中复发的有25例，未采纳组为40例，差异有统计学意义。即同时检测阿司匹林、氯吡格雷代谢相关基因，并可更全面地优化IS给药方案，并提高二级预防的疗效，降低IS复发的风险。

同时，本研究也存在一定局限性：未纳入其他一些干扰因素，如血管狭窄患者是否行介入治疗；胃肠疾病患者是否在服用氯吡格雷的同时服用质子泵抑制剂，如奥美拉唑可降低氯吡格雷的有效性[18]；未纳入血小板抑制率检测[19]。希望未来能有更全面的研究方案得出更可靠的证据来为临床提供参考。