维生素D受体在食管鳞癌中的表达及其与预后的关系

孔金玉，王 健，刘怡文，孙 蔚，原 翔，高社干

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在中国90%以上为鳞状细胞癌[1-2]，而目前的预防及治疗手段欠佳，多数患者仍不能得到有效控制，5 a生存率很低[3]。维生素D(vitamin D，VD)是一种与人体健康密切相关的脂溶性维生素。长期以来，人们对VD的研究主要集中在钙、磷代谢的调节作用，近年来，VD在抗肿瘤方面的研究受到越来越多的关注。大量研究表明，VD及其类似物可通过抑制肿瘤细胞增殖、浸润与转移、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、抗血管生成等方式发挥抗肿瘤作用[4]。VD发挥生物学效应的受体是广泛分布于体内诸多组织内的VD受体(vitamin D receptor，VDR)。目前，VDR与肿瘤的研究主要集中在乳腺癌、肺癌和结肠癌等[5-7]，关于VDR在食管鳞癌组织中的表达水平及与临床病理特征、预后的相关性鲜有报道。本研究拟采用实时定量PCR法检测食管鳞癌组织中VDR的表达水平，并分析其与临床病理特征、预后之间的关系，探讨VDR在食管鳞癌发生、发展中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究为回顾性研究，收集河南科技大学第一附属医院2012年1月至2014年12月具有明确病理学诊断的原发性食管鳞癌患者组织标本114例，其中男73例，女41例；年龄40～73岁，中位年龄61岁；淋巴结转移者56例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期66例，Ⅲ期48例。另取其中50例手术切除的癌旁组织作为对照，全部标本收集后立即于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂与仪器TRIzol LS Reagent及TaqMan Expression Kit(美国，Invitrogen)；M-MLV逆转录酶、0.1 mM DTT、5×First Buffer、RNase Inhibitor和GADPH(美国，Applied Biosystems)。NanoDrop ND1000紫外可见分光光度计(美国，Thermo)，7900HT荧光定量PCR(美国，Applied Biosystems)。

1.3 实时定量PCR方法检测VDR mRNA的表达水平取食管癌或癌旁组织标本100～200 mg，液氮中研磨成粉末状；加入1 mL的TRIzol，混合均匀；加入200 μL氯仿，12 000 r·min-1，4 ℃离心30 min；加入等体积异丙醇，-20 ℃放置2 h；12 000 r·min-1，4 ℃离心30 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇，洗涤RNA，混匀；12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min；重复洗涤1次；NanoDrop紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度；1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA是否降解；稀释至工作浓度(50 ng·μL-1)，-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒进行cDNA合成，总反应体系为12 μL。逆转录反应条件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃15 min。cDNA 样本在-20 ℃保存。按照TaqMan mRNA Assays的说明进行实时荧光PCR，检测mRNA表达水平。每个PCR 反应体系为5 μL，设3个复孔，反应条件：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；40个循环。以GADPH为内参，Log10(2-ΔΔCt)表示VDR mRNA相对表达量。

1.4 随访根据病历信息进行随访，死于其他疾病、失访或随访截止时间仍存活视为截尾数据。114例患者中死亡66例，均死于食管癌相关的并发症或复发远处转移；总生存期(overall survival, OS)定义为确诊日期至死亡日期或最近一次随访日期(2020年12月)。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件包进行统计分析，采用 Log10(2-ΔΔCt)计算mRNA相对表达量，mRNA在癌和相应癌旁组织中的表达比较采用配对t检验，VDR mRNA表达水平与临床病理特征的相关性采用χ2检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验生存时间的差异。α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR mRNA在食管鳞癌及癌旁组织中的表达水平应用实时定量PCR方法检测50例食管鳞癌及相应的癌旁组织中VDR mRNA的表达水平，结果显示，VDR mRNA在食管鳞癌组织中平均表达水平(5.39 ± 0.52)低于癌旁组织(5.92 ± 0.54)，差异有统计学意义(t=4.958，P<0.05)。见图1。

图1 VDR mRNA在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达水平

2.2 VDR mRNA表达与临床病理特征相关性分析进一步检测VDR在114例食管鳞癌中的表达，利用VDR mRNA表达的中位值(5.550)将患者分成高表达、低表达两组。如表1所示，VDR基因表达水平和性别(χ2=6.437，P=0.011)、吸烟(χ2=3.947，P=0.047)和淋巴结转移相关(χ2=5.054，P=0.025)，差异有统计学意义。

表1 食管鳞癌组织中VDR mRNA表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.3 VDR mRNA表达与食管鳞癌预后的关系运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验比较生存时间的差异，分析VDR mRNA表达与食管鳞癌患者预后的相关性，图2结果显示，114例食管鳞癌患者术后VDR mRNA高表达组中位生存期为65.5个月，明显高于低表达组(22.7个月)，提示VDR mRNA高表达与食管鳞癌患者生存预后较好有关(χ2=4.906，P=0.027)。

图2 食管鳞癌中VDR mRNA高表达与低表达的生存曲线

3 讨论

维生素D是一种脂溶性的类固醇衍生物，在骨代谢和钙稳态中发挥重要作用，近年来研究发现，VD具有潜在的抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移、诱导细胞凋亡、促进细胞分化等。除此之外，VD还参与调节免疫、抑制炎症等多个生物学过程[8]。VDR广泛分布于小肠、肾、骨、皮肤、甲状旁腺、结肠、乳腺、胰腺等正常组织中，同时也表达于这些组织的癌细胞中[9]。VD的生物学功能是通过与VDR结合调节靶基因转录来实现的，当游离的1,25(OH)2D3进入细胞后被转移至核内，与VDR结合并使VDR发生磷酸化，从而导致VDR构象的改变，进而与类视黄醇X受体(retinoid X recepto，RXR)结合形成异质二聚体，VD-VDR复合物作为转录因子，作用于其靶基因启动区中的特异DNA序列(维生素D反应元件，vitamin D responsive element，VDRE)，从而激活或抑制基因转录[10]。

VDR表达于大多数肿瘤细胞中，包括食管癌。既往VDR和食管癌的研究主要为腺癌，在食管腺癌中VDR表达水平随着肿瘤去分化而下降。与食管正常鳞状上皮相比，VDR在Barrett食管黏膜中的表达显著升高[11-12]。在食管鳞癌细胞中VDR基因多态性和不良预后相关[13]。Mimori K等[14]研究发现，与正常食管组织相比，VDR在食管癌组织中表达较低，其低表达与预后较差相关，表现为肿瘤细胞的淋巴结转移、浸润侵袭及血行扩散能力增强。该研究提示VDR表达下调可能在食管癌的进展中发挥着重要作用，而VDR基因表达上调具有改善食管癌预后的潜在可能。另外，相关体外及动物模型研究表明，VD能抑制食管鳞癌细胞增殖，使细胞周期阻滞在G0/G1期，并诱导肿瘤细胞凋亡[15-16]。

本研究采用实时定量PCR法检测VDR mRNA在食管鳞癌中的表达水平，并分析其与临床病理特征及预后的相关性。研究发现VDR mRNA在食管鳞癌组织中的表达显著低于相应的癌旁组织。VDR mRNA低表达与预后较差、生存时间较短相关。本研究结果与相关文献报道一致[14]。除此之外，VDR mRNA表达与食管癌患者性别、吸烟及淋巴结转移相关，提示VDR mRNA低表达在食管癌患者中男性多于女性，吸烟患者多于非吸烟患者，VDR mRNA低表达患者易发生淋巴结转移。

综上所述，本研究表明VDR mRNA在食管鳞癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，且其表达与患者的临床病理类型及预后密切相关。VDR有望成为食管鳞癌预后的判断指标及潜在的治疗靶点。