含铜L605钴基合金材料对血管内皮化的影响

戚 勋，王 鹏，张书源，徐 克*

(1.中国医科大学附属第一医院放射科 辽宁省影像诊断与介入治疗重点实验室，辽宁 沈阳 110002；2.中国科学院金属研究所，辽宁 沈阳 110016)

下肢动脉硬化闭塞症指下肢动脉因动脉粥样硬化病变致管腔进行性狭窄或闭塞[1]，发病率逐年升高。以血管支架植入术为主的介入手段现已成为动脉粥样硬化所致下肢动脉狭窄/闭塞性病变、尤其是长段闭塞性病变的首选治疗方法[2-3]，展现出诸多优势，但术后支架内再狭窄(in-stent restenosis, ISR)风险严重影响中、远期疗效，并限制其广泛应用[4]。与第一代支架体材料不锈钢相比，第二代药物洗脱支架体材料L605钴基合金具有更高的抗拉强度，在保持支架原有径向张力的同时小梁更细，有利于降低ISR发生率[5]，临床应用广泛。但是，目前已用于临床的药物洗脱支架存在晚期ISR风险，其主要发生机制在于药物洗脱涂层完全降解后，药物已完全释放而不能发挥生物学功能，但此时内皮化不完全，平滑肌细胞过度增殖，促进ISR发生[6]。铜离子是人体内必需的微量金属元素，人体每天需摄入足够量铜离子，以维持正常生理功能[7]。研究[8-10]表明，在金属支架体材料中加入适量铜元素，经过特殊热处理，可在维持原有力学支撑力的同时均匀弥散分布富铜相；铜在人体体液中易发生腐蚀，可微量和持续释放铜离子，以发挥微量铜的生物学功能。既往研究[11]发现，316L-Cu不锈钢具有良好的促进内皮化作用。本研究观察不同含铜量L605钴基合金材料对血管内皮化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(human umbilicus endothelial cell， HUVEC)购于南京凯基生物，将其接种于含10%胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内进行培养，待细胞生长融合至80%～90%用于实验。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8， CCK-8)购于日本Dojindo公司，Transwell小室购于美国Millipore，基质胶购于美国BD公司，青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)、RPMI 1640培养基和胰蛋白酶均购于南京凯基生物。

1.2 制备浸提液 根据ISO 10993-5规定，分别取尺寸为Φ10 mm×1 mm的L605-2.0 Cu(含铜量2.0wt%)、L605-2.5 Cu(含铜量2.5wt%)、L605-3.5 Cu(含铜量3.5wt%)及L605钴基合金，以121℃高温高压蒸汽灭菌30 min后，于无菌条件下制备浸提液，以1.25 cm2/ml浸泡于RPMI 1640培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，培养72 h后取出浸提液进行后续实验。

1.3 检测细胞增殖能力 采用CCK-8检测共培养条件下L605钴基合金对细胞增殖的影响。将80%～90%融合细胞随机分为4组，即L605-2.0 Cu组、L605-2.5 Cu组、L605-3.5 Cu组及L605组，分别于96孔板中加入尺寸为Φ5 mm×1 mm的相应L605钴基合金，每组设5个复孔。将HUVEC制成浓度为3×104/ml的细胞悬液，分别取100 μl加至各组96孔板中，培养48 h后吸出原有培养基，加入含0.5% FBS培养液预处理24 h，使细胞同步化；再培养24 h后，吸出培养液，加入培养液及CCK-8预混液110 μl(体积比10∶1)。于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2.5 h后，取出样品，放入酶标仪(Multiskan GO，Thermo Scientific)，于450 nm波长处检测光密度(optical density, OD)值。

1.4 检测细胞迁移能力 采用Transwell小室法检测L605钴基合金材料对细胞迁移能力的影响。取80%～90%融合细胞，吸出原培养基，加入含0.5% FBS的培养液预处理24 h后，使用无血清培养基将细胞制成浓度为3×104/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液加入至Transwell上室，下室分别加入L605、L605-2.0 Cu、L605-2.5 Cu和L605-3.5 Cu浸提液600 μl，每组设3个复孔。在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h后取出小室，弃去培养液，用无钙PBS漂洗2遍后，以95%乙醇固定30 min；将小室适当风干，用0.1%结晶紫染色20 min后，以棉签轻拭，去除上层未迁移细胞，以PBS漂洗3遍。于显微镜下随机挑选5个视野观察细胞并记数。

图2 各组内皮细胞与不同浸提液作用后小管形态、长度及分支数(×400) A.L605组； B.L605-2.0 Cu组； C.L605-2.5 Cu组； D.L605-3.5 Cu组

1.5 检测血管生成能力 采用内皮细胞小管形成实验观察L605钴基合金对血管生成能力的影响。取80%～90%融合细胞，吸出原培养基，加入含0.5% FBS的培养液预处理24 h备用。向96孔板中的每孔加入50 μl Matrigel基质胶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育30 min，待基质胶凝固后备用。预处理细胞消化后，每孔加入100 μl浓度为5×105/ml的细胞悬液，并分别加入100 μl含10% FBS的L605钴基合金浸提液，置于37℃细胞培养箱中孵育3 h，在倒置显微镜下观察，使用ImageJ软件量化小管长度及节点数。

1.6 统计学分析 采用PRISM 6.0统计分析软件。计量资料以±s表示，以单因素方差分析行多样本间比较，组间两两比较采用Bonferroni校正t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

以不同含铜量L605钴基合金干预细胞48 h后，L605-3.5 Cu组OD值高于L605组(P<0.05)，L605-2.5 Cu组、L605-2.0 Cu组与L605组OD值差异均无统计学意义(P均>0.05)。将不同含铜量L605钴基合金浸提液与细胞共培养24 h后，各组细胞形态均良好，L605-3.5 Cu组穿膜细胞数高于L605组、L605-2.0 Cu组(P均<0.01)，L605-2.0 Cu组与L605组差异无统计学意义(P>0.05)；L605-3.5 Cu组小管生成总长度及节点数均高于其他3组(P均<0.01)，L605-2.5 Cu组、L605-2.0 Cu组与L605组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1、2及表1。

图1 各组Transwell实验中细胞迁移情况(结晶紫染色，×200) A.L605组； B.L605-2.0 Cu组； C.L605-2.5 Cu组； D.L605-3.5 Cu组

表1 不同含铜量L605钴基合金组间OD值、穿膜细胞数、小管生成总长度及节点数比较(±s)

表1 不同含铜量L605钴基合金组间OD值、穿膜细胞数、小管生成总长度及节点数比较(±s)

组别OD值穿膜细胞数(个)小管生成总长度(mm)节点数(个)L605组0.60±0.0483.00±21.4411.71±1.6027.00±3.16L605-2.0 Cu组0.61±0.0381.00±8.92**11.24±1.3928.60±6.35L605-2.5 Cu组0.64±0.0198.20±13.4112.38±2.0230.60±7.13L605-3.5 Cu组0.68±0.05*126.00±17.64**19.70±1.63**#&47.40±8.85**#&F值4.4008.37728.3709.953P值0.0190.001<0.001<0.001

注：*：与L605组比较，P<0.05；**：与L605组比较，P<0.01；#：与L605-2.0 Cu组比较，P<0.01；&：与L605-2.5 Cu组比较，P<0.01

3 讨论

近年来，药物洗脱支架研究进展迅速。目前临床用于治疗下肢动脉病变的自膨式记忆合金药物洗脱支架主要以紫杉醇作为洗脱涂层药物。既往研究[4,12]表明，紫杉醇在抑制平滑肌细胞增殖的同时阻碍内皮细胞增殖，导致血管内皮化不完全，血管自然愈合延迟，使晚期血栓形成发生率较高。一项多中心临床试验[13]对比观察雷帕霉素药物洗脱支架与裸支架治疗股浅动脉病变效果，发现术后随访6个月时药物洗脱支架通畅率稍高于裸支架，但随访24个月时二者通畅率无明显差异，原因在于药物洗脱涂层随时间延长而逐渐降解，药物完全释放后不具有生物学功能，此时内皮化尚不完全，平滑肌细胞过度增殖而促进ISR发生[6]。

铜为重金属元素，铜离子不仅抑制血栓形成，还能有效促进内皮细胞增殖并抑制平滑肌细胞过度增殖[14]。根据既往研究[11,15]结果，同时考虑到铜对力学性能的影响，本研究分别制备含铜量为2.0wt%、2.5wt%和3.5wt%的L605钴基合金，使其既能提高支架材料自身的生物性能，又可保证生物安全性，以期解决支架植入后中、远期再狭窄问题。

内皮细胞增殖、迁移及小管生成是评价血管内皮化的重要指标[16]。内皮细胞增殖、迁移能力增强促进管腔结构形成。本研究以CCK-8检测各组材料对细胞增殖能力的影响，采用Transwell小室实验检测细胞迁移能力，以小管生成实验观察血管形成能力。本研究结果显示，L605-3.5 Cu促进HUVEC增殖效应最显著，酶标仪检测L605-3.5 Cu的OD450为L605的1.13倍，表明L605-3.5 Cu可显著促进内皮细胞增殖；与L605、L605-2.0 Cu和L605-2.5 Cu浸提液相比，L605-3.5 Cu浸提液可显著增加内皮细胞小管生成的小管生成总长度和节点数。上述体外实验研究结果证实L605-3.5 Cu合金具有明显促内皮化作用，有望解决预防ISR难题，为L605-3.5 Cu合金体内试验和临床应用提供了实验依据。

综上，含铜L605钴基合金材料可促进血管内皮化，体外实验结果显示以含铜量为3.5wt%的L605-3.5 Cu效果最显著，值得后续研究并进行深入观察。