miRNA-191-5p与微管相关蛋白1轻链3及Beclin-1在脓毒症急性肺损伤中的相关性*

郭壮波 张锐 李燕威

（1广东省广州市红十字会医院急诊科 广州510220；2广东省广州市红十字会医院中心ICU 广州510220）

有研究表明,脓毒症（Sepsis）是一种由感染引起的全身炎症反应综合征,严重者可致全身多脏器衰竭,甚至死亡[1]。其中急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS）是脓毒症患者的重要死因,表现为患者出现急性呼吸衰竭,急性肺实质及肺血管损伤等[2]。有研究表明,自噬异常与多种疾病的发生相关,如癌症、免疫系统疾病等[3～4]。自噬与脓毒症的相关性也有多种研究证实,自噬对脓毒症具有一定的内源性保护作用[5]。miRNA是一种非编码RNA,长度多在20～24个核苷酸,主要通过竞争性结合mRNA并抑制其翻译而发挥作用,并在多种疾病的发生发展中发挥着重要作用[6]。有研究表明,miRNA-191-5p在肿瘤及神经系统疾病中发挥着重要作用,在脓毒症急性肺损伤中的作用尚无相关研究,所以本研究旨在通过检测临床脓毒症急性肺损伤患者血清miRNA-191-5p表达量与自噬相关蛋白微管相关蛋白 1轻链 3（Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3, MAPLC3）及Beclin-1的相关性,分析其对脓毒症急性肺损伤患者的影响。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料以及血样采集 本研究经我院医学伦理委员会批准,所有患者及家属签署知情同意书。选取2017年1月～2019年5月收治的确诊为脓毒症急性肺损伤患者80例,住院期间接受标准化治疗。记录所有患者年龄、性别、体质指数、心率、呼吸及体温,采集患者入院第2天空腹静脉血10 ml于血清分离胶采血管,上下混匀,静置20 min,3 000 r/min离心5 min。在4℃环境中转移血清于冻存管中,保存于-80℃冰箱待检。

1.2 纳入标准及排除标准 纳入标准:符合脓毒症诊断标准[7]；符合2012年ARDS柏林诊断标准[8],确认并发急性肺损伤。排除标准:其他系统并发器官衰竭；长期接受免疫治疗；伴有肝脏、肾脏等重要器官疾病；患者及家属拒绝入组。

1.3 主要试剂 PCR引物购自北京擎科新业生物技术有限公司。逆转录PCR试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TMII试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.4 qRT-PCR检 测miRNA-191-5p、MAPLC3、Beclin-1在血样中的表达量 4℃环境处理血样,加入1 ml Trizol溶液（invitrogen公司）进行RNA裂解血样,按照Trizol说明书提取血样总RNA,然后使用nanodrop测定RNA的浓度以及纯度,纯度在1.8～2.2可用。使用TaKaRa公司的逆转录试剂并按照产品说明书合成cDNA以备用。见表1。实时定量PCR反应体系,反应体系包括:2×SYBR Green Qpcr Master Mix 10μl,1μl上游引物,1μl下游引物,7μl的ddH2O,1μl的模板cDNA,总反应体系20μl。

表1 引物序列表

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件分析数据,计量资料采用（±s）表示,应用t检验,计数资料采用%表示,应用χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-191-5p表达量经检测,患者miRNA-191-5p表达量分布如下。见图1。根据miRNA-191-5p表达量中位数,分为miRNA-191-5p高表达组和低表达组,每组40例。

图1 miRNA-191-5p表达量分布

2.2 miRNA-191-5p高表达组和低表达组一般资料比较 经检测,两组患者的基线资料如下,两组患者在年龄、性别、体质指数、心率、呼吸及体温比较无显著差异（P＞0.05）。见表2。

表2 miRNA-191-5p高表达组和低表达组一般资料比较(±s)

表2 miRNA-191-5p高表达组和低表达组一般资料比较(±s)

指标 miRNA-191-5p高表达组（n＝40）miRNA-191-5p低表达组（n＝40） t/χ2 P年龄（岁）性别（例） 男女体质指数（kg/m2）心率（次/min）呼吸（次/min）体温（℃）40.56±19.87 21 19 20.34±2.87 90.45±3.45 30.87±4.56 38.38±4.16 41.08±18.45 18 22 20.38±3.08 91.03±2.87 31.05±5.02 38.65±3.85 0.121 3 0.450 0 0.060 1 0.817 4 0.167 9 0.301 3 0.903 8 0.502 0 0.952 2 0.416 2 0.867 1 0.764 0

2.3 miRNA-191-5p高表达组和低表达组的MAPLC3、Beclin-1表达量 分别检测miRNA-191-5p高表达组和低表达组MAPLC3及Beclin-1及表达量。见图2。miRNA-191-5p高表达组的MAPLC3、Beclin-1表达量均高于miRNA-191-5p低表达组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 MAPLC3表达量

图3 Beclin-1表达量

3 讨论

脓毒症多因感染引起,导致机体功能紊乱,多器官发生衰竭风险,其中肺脏最易受损,所以脓毒症急性肺损伤或者进展为急性呼吸窘迫综合征是临床较常见的症状,加大了临床治疗脓毒症的难度,患者死亡率也有所增加[9]。miRNA是一种长度20～24个核苷酸的非编码RNA,可以通过与mRNA竞争性结合,调节下游基因的转录及翻译,从而参与多种生物进程,在多种信号通路中发挥重要作用,与多种疾病的发生发展相关。自噬广泛分布于机体,参与维持机体代谢平衡、物质代谢与更新等,并且会随着机体变化有相应的适应[10]。自噬可以促进物质的循环利用,对破损细胞器进行清除,有效促进细胞的内环境稳态。Beclin-1是酵母自噬相关蛋白基因（Autophagy-related Gene, ATG）6同系物,MAPLC3是ATG8基因同源物,在哺乳动物体内调节自噬,Beclin-1调节自噬体的定位,MAPLC3调节自噬体的形成,可与自噬泡膜表面结合,二者可以作为自噬体的特异性标志蛋白。miRNA作为一种在真核生物中的发挥结合抑制作用的单链非编码RNA,在人体内广泛存在[11]。已有多种研究发现早期脓毒症患者中的miRNA与自噬相关,但miRNA-191-5p的相关研究还没有。本研究通过应用RNA提取、RNA逆转录、荧光定量PCR检测脓毒症急性肺损伤患者miRNA-191-5p与MAPLC及Beclin-1表达水平,并进一步分析其表达量之间的相关性。本研究发现,miRNA-191-5p的表达量与MAPLC及Beclin-1 mRNA表达水平相关。说明miRNA-191-5p可能与自噬相关,高表达量可以促进自噬发生。MAPLC及Beclin-1是用于监测自噬水平的重要标志物。自噬可以调节机体的炎症反应,当脓毒症发生时,机体受到重创,更高的自噬水平可以保护机体,协助机体调节自身状态,促进机体稳态的恢复,保持内环境稳定。除此之外,自噬的发生发展与很多信号通路相关,之前有研究表明mTOR信号通路可能与自噬的调节有关[12]。本研究结果提示miRNA-191-5p与MAPLC及Beclin-1在脓毒症急性肺损伤相关,为后续研究提供了一定的基础,miRNA-191-5p有希望成为脓毒症急性肺损伤进一步治疗的靶标。

综上所述,miRNA-191-5p在脓毒症急性肺损伤中与微管相关蛋白1轻链3及Beclin-1相关。