基于PCA和聚类分析方法对云南不同茶区晒青毛茶生化成分分析

杨雪梅,刘莹亮,李家华,王智慧,赵建锐,李 梅,*

(1.滇西应用技术大学普洱茶学院,云南普洱665099; 2.云南农业大学龙润普洱茶学院,云南昆明 650201)

云南大叶种晒青毛茶是以云南地理区域范围内大叶种茶树鲜叶为原料,经杀青、揉捻、日光干燥后制成的普洱茶原料[1-2],其品质化学成分主要有茶多酚类、游离氨基酸类、生物碱类、茶多糖类、色素类、皂苷及一些香气物质[3-5]。茶叶的品质与内含成分的构成比例密切相关[6]。但由于云南地理区域环境差异大,导致不同茶区晒青毛茶的品质不同。其次,晒青毛茶在加工过程中,其内在的化学成分在一定温度、氧化酶的作用下会发生水解、聚合等变化,这些变化很大程度上影响了茶叶的香气、滋味及色泽。茶多酚中黄烷醇(儿茶素)类化合物是形成茶叶色香味的主要成份之一,也是茶叶中有保健功能的主要成份之一[7-8]。其中,云南大叶种的黄烷醇类相比小叶种含量较高,表儿茶素没食子酸脂含量接近甚至高于表没食子儿茶素没食子酸脂,并含有较多的简单儿茶素(如儿茶素和表儿茶素),其含量往往也高于表没食子儿茶素[9-10],这是云南大叶种区别于其它茶树品种的典型特征。

近年来,随着人们对普洱茶品质的追求,很多学者对普洱茶品质化学的研究不断深入,但是目前学者主要研究是普洱茶的仓储环境、时间等影响因子与品质之间的相关性[11-13]。对云南不同茶区晒青毛茶品质的研究鲜有报道[14-15]。故本文拟采用高效液相色谱法测定了云南不同茶区28份晒青毛茶的主要生化成分;利用主成分分析方法和聚类分析方法进行类群划分和生化成分分析。旨在通过了解晒青毛茶生化成分含量特点以及类群之间的差异性,为普洱茶产品的复配技术提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验茶样选用2017年月采制的28份晒青毛茶(如表1) 由勐海臻味号茶叶股份有限公司提供,茶样采制标准为一芽二叶,毛茶加工工艺基本按照统一标准；茚三酮 中国医药公司北京采购供应站;氯化亚锡 天津市化学试剂三厂;磷酸、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠 天津市风船化学试剂科技有限公司;硫酸亚铁、酒石酸钾钠 天津市双船化学试剂厂;乙醇95% 汕头市西陇化工厂有限公司;以上试剂均为分析纯;甲醇、乙腈 美国安捷伦有限公司,色谱纯。

表1 供试茶样一览表Table 1 Detail information of tea samples

BS201S数显电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;TGL-16G高速台式离心机 上海医用仪器分析厂;IEC高速冷冻离心机 Thermo Electron corporation;NEX纯水仪 普析通用;KS-250D超声波清洗仪 宁波海曙科超声设备公司;101-3ABS恒温电热干燥箱 北京市用光明医疗仪器厂;X-5紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;DFD-700数显恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂;1200HPL高效液相色谱 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多酚的测定方法 按GB/T 8313-2002方法进行测定[16]。分别用移液管精确取2 mL供试品溶液至10 mL离心管中,加入2 mL酒石酸铁溶液、6 mL pH=7.5的磷酸缓冲液,摇匀离心,吸取上清液,置于紫外/可见分光光度计中测定吸光度,并按下式计算茶多酚含量。

茶多酚(%)=(吸光度×3.913/1000)×(总试剂的量/取试剂的量×试样干物重)×100

1.2.2 游离氨基酸的测定方法 按GB/T 8314-2013方法进行测定[17]。吸取茶汤提取液1 mL,置于25 mL容量瓶中,再加0.5 mL磷酸盐缓冲液,加2%茚三酮水溶液0.5 mL,在沸水浴中加热15 min,冷却后,加水定容至25 mL,放置5～10 min,置于紫外/可见分光光度计中测定吸光度,并按下式计算游离氨基酸含量。

游离氨基酸总量(10 μg.g-1)=[(A×0.57)/1000×稀释倍数/样品干物重]

注:稀释倍数为制备茶汤时所用容量瓶的体积500 mL。

1.2.3 儿茶素类、咖啡碱的测定方法 参照文献方法进行测定[18-19]。混标样的配制:每个标样称10 mg(准确至0.01 g),用70%甲醇溶解,定容至10 mL,0.22 μm膜过滤得1 mg/mL标品;每个标样各取1 mL定容至10 mL,混合成0.1 mg/mL混标。

供试样品的制备:称取茶样(磨碎)50 mg,先加入2%磷酸10 mL之后加10 mL甲醇(色谱纯),混合后静置1 h,用0.45 μm有机膜进行过滤,再进入液相色谱仪检测。重复3次取平均值记结果。

1.2.4 含水量的测定方法 参照文献方法进行测定[20]。将洁净的烘皿连同盖置于(103±2) ℃的干燥箱内加热1 h,加盖取出,于干燥器内冷却至室温,称量(准确至 0.001 g)。称取5 g试样于已知质量的烘皿中,置于(103±2) ℃干燥箱内加热4 h,加盖取出,于干燥器内冷却至室温,称量。再置于干燥箱中加热1 h,加盖取出,于干燥器内冷却,称量。重复加热1 h 的操作,直至连续2次称量差不超过0.005 g,即为恒重,以最小称量为准。

水分含量(%)=(m1-m2)/m0×100

式中:m1-试样和烘皿烘前的质量,g;m2-试样和烘皿烘后的质量,g;m0-试样的质量,g。

1.2.5 水浸出物的测定方法 按GB/T 8305-2002方法进行测定[21]。称量2 g(精确到 0.001 g)磨碎试样于500 mL锥形瓶,加沸蒸馏300 mL,立即移入沸水浴中浸提45 min(每隔10 min摇动一次),趁热过滤。用150 mL沸蒸馏水洗涤茶渣数次,将茶渣连同已知质量的滤纸移入铝盒内,然后移入(120±2) ℃的恒温干燥箱内烘1 h,加盖取出冷却1 h再烘1 h,立即移入干燥器内冷却至室温,称量。

水浸出物含量(%)=(1-m1/(m0×w))×100

式中:m0-试样质量,g,m1-干燥后的茶渣质量,g,w-试样干物质含量(%)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 生化成分分析

表4是28份大叶种茶树晒青毛茶主要生化成分的测定结果,晒青毛茶生化成分是影响茶叶口感滋味和香气变化的重要物质基础,同时也是茶叶拼配需要考察的重要因素。从表4显示,28份实验样品中氨基酸、咖啡碱、儿茶素多样性指数和变异系数都较高,说明实验样品间这些成份存在明显差异;10个指标中多样性指数最大的为儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸脂,其中,儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸脂变异系数较大,说明3种生化成分在测试的供试样中相比其它成分有较大不同,多样性较广泛,也说明了云南大叶种茶树以非酯型儿茶素组成及表现上更加丰富。

表4 参试材料主要生化成分基本统计参数和遗传多样性指数Table 4 The basic statistical of test material in biochemical composition and genetic diversity index

表5是7种生化成分存在较大差异的供试样分析结果。从表5可知,在茶叶4项常规成分中双江县勐库春供试样的茶多酚和水浸出物含量最高,分别达38.72%和55.56%,而在云县白莺山春供试样的茶多酚含量最低,仅为19.80%;景谷县黄草坝春供试样中含氮化合物氨基酸和咖啡碱的含量最大,含量分别达6.42%和4.70%,云县白莺山春供试样的咖啡碱含量最少为1.82%,易武弯弓春供试样的氨基酸含量最低为3.26%。从儿茶素组分的含量可知,景谷县黄草坝春供试样中表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸脂和总量都远大于其他6个供试样。从酯型儿茶素占儿茶素总量的含有率可知,除易武弯弓春和老班章春2个供试样中酯型儿茶素占儿茶素总量的含有率大于70%以外,其余5个供试样都≤50%。表现出了云南茶树种质资源原始性的特点。

表5 生化成分存在较大差异的茶样间组分比较Table 5 Analysis of major biochemical composition of tea samples with large difference

2.2 主成分分析

表6是28份实验样品中主要生化成分进行主成分分析,得到4个主成分(Z1～Z4),累计贡献率达87.20%。

表6 主成分特征值、贡献率和累积贡献率Table 6 Eigenvalue,proportion and cumulative proportion obtained by PCA

从表6和表7可知,主成分Z1贡献率是26.56%,主要反映EGCG、C、GA、EGCG+EGC、EGCG+ECG 5个儿茶素类的信息,其中C的向量系数为0.985,酯型儿茶素的系数为0.791。主成分Z2贡献率是21.12%,主要反映了GA(没食子酸)、TP(茶多酚)、TCC(儿茶素总量)和咖啡碱的信息,TP和TCC的系数值分别为0.926和0.955。主成分Z3贡献率是20.62%,主要反映EGC、EC、GA、EGC+EC的信息,其中非酯型儿茶素的系数为0.963。主成分Z4贡献率是18.91%,主要反映ECG、EC、C、EGCG+ECG、ECG+EC和氨基酸的信息,氨基酸在分析中的最大系数仅为0.425,说明氨基酸在茶树分类中的贡献不是太明显,其中邻苯二酚型儿茶素的系数为0.991,反映的是较原始的古茶树信息。表7标示出的值均赋予了该主成分很高的正相关性,表现出较大的贡献并反映出该项因子在分析中的较大依存性。

表7 主成分特征向量Table 7 Eigenvectors of PCA

2.3 聚类分析

聚类分析结果如图1所示,28份来自不同区域的实验样品被分为了6个类群,其中A类群主要分布地为滇南,包括双江勐库在内的8个实验样品,该类群的特点是茶多酚含量均大于31%,ECG含量都大于4.5%,除冰岛和布朗山大寨,其它材料的ECG含量均高于EGCG,表现出了云南大叶种儿茶素含量的特点。B类群主要分布地在滇西南,包括黄草坝、大树山在内的材料5份,该类群表现出了氨基酸含量高的特点,除勐海邦盆略低外组内其它材料均大于5.5%,咖啡碱含量均值3.63%,儿茶素总量均值20.46%,其中C、EGCG含量都显著高于其它类群。C类群主要分布于版纳茶区,包括勐海勐宋在内的3份材料,3份材料的EC含量大于3%,超过其它类群。D类群主要分布于勐海,包括布朗山帕亮在内的5份材料,D类群茶多酚含量大于30%,其中ECG含量均值3.68%、EGCG含量均值3.99%,两者含量上很接近,而且该群EGC含量显著高于其它类群含量,最大的是勐海老曼娥达到3.86%,表现出了资源原始性的特点。E类群仅云县白莺山材料1份,在所有材料中儿茶素总量、咖啡碱、水浸出物及茶多酚含量最低,但氨基酸含量最高,推测该茶可能为野生种。F类群主要分布地在勐腊地区,包括易武一扇磨春茶在内的材料6份,该类群茶多酚含量30%左右,但儿茶素总量最少,仅EGCG、ECG含量略高外其它成分显著较少。另外B、C、D类群的水浸出物含量明显高于其它类群。上述分析结果可反映出云南大叶种茶树资源广泛,存在较大变异、且原始性的特点。

图1 聚类分析图Fig.1 Cluster diagram

3 结论

28份晒青毛茶样中氨基酸、咖啡碱、儿茶素多样性指数和变异系数都较高,说明供试茶样中的生化成份存在明显差异;10个生化指标中多样性指数最大的为儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸脂,分别是1.91、1.91、1.97、1.90。其中,又以儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素变异系数较大,分别为56.88%、36.41%和49.52%,说明三种生化成分在测试的供试样中相比其它成分有较大不同,多样性较广泛,也说明了云南大叶种茶树以非酯型儿茶素组成及表现上更加丰富。通过聚类分析将供试样划分为6个类群,并且类群之间生化成分含量存在一定差异。说明云南大叶种茶树资源广泛,存在较大变异、且原始性的特点。因此,可为普洱茶产品的复配技术提供数据支撑,也为消费者合理、正确选择普洱茶产品提供一定的理论依据。