薏苡种质资源ISSR分子标记筛选及亲缘关系分析

陆秀娟 潘虹 李祥栋 魏心元 陆平 石明

摘要：利用ISSR标记对92份薏苡种质进行遗传多样性分析，结果表明，从100条ISSR通用引物中筛选出11条多态性较好的引物，共扩增出49条多态性条带，多态性条带占各自总条带的比例为66.6%～100.0%;非加权组平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）对92份薏苡种质的聚类结果一致，均分为3个类群，云南、贵州、福建3个省份的种质表现出比较丰富的遗传多样性，其他省份的多样性水平相对较低。

关键词：ISSR标记;遗传多样性;种质资源;薏苡;类群;主成分分析

中图分类号： S519.024  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）05-0032-05

收稿日期：2018-04-23

基金项目：贵州省科技计划（编号：黔科合重大专项字[2014]6023、黔科合支撑[2016]2608）;贵州省高层次创新型人才培养項目（编号：黔科合人才[2015]4016）。

作者简介：陆秀娟（1989—），女，布依族，贵州册亨人，从事作物栽培与生物技术研究。E-mail：lowaterve_643@126.cm。

通信作者：李祥栋，农艺师，从事植物生理与分子调控研究，E-mail：lixiangdongsiji@163.com;石 明，研究员，从事作物遗传育种研究，E-mail：shiming1616@126.com。

种质资源的遗传多样性是育种的基础，科学、准确地评价种质资源的遗传多样性，从整体上把握物种资源的遗传变异信息及亲缘关系远近，可有针对性地选择合适亲本，为遗传育种工作提供有益参考。

薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡属1年生或多年生草本植物，是重要的药食同源作物之一。目前，薏苡属作物在世界范围内约有10个种或变种，《我国植物志》将薏苡属分为5个种4个变种[1]。DNA分子标记是研究遗传多样性和亲缘关系的重要工具，近年来，Qin等采用扩增片段长度多态性（AFLP）、相关序列扩增多态性（SRAP）、简单重复序列标记（SSR）等分子标记方法对薏苡种质进行筛选应用[2-5]。Ma等利用17对SSR引物聚类分析来自我国和韩国的79份薏苡种质资源时发现，我国薏苡和韩国薏苡有着比较远的亲缘关系，大部分我国薏苡聚为1类，而所有的韩国薏苡被聚为1类[6]。江忠东等以薏苡（原变种）、念珠薏苡（变种）、薏米、水生薏苡、小珠薏苡等42份薏苡属植物为材料，筛选出5对与落粒性基因相关的STS引物，并对薏苡属植物的DNA多样性进行了分析，根据DNA多态性特征讨论了薏苡属植物的遗传进化关系[7]。当前，薏苡的基因组信息尚未公布，相关遗传性研究所用的标记数量极为有限。简单重复序列区间标记（inter-simple sequence repeats，ISSR）由于不需要知道研究材料的遗传背景，多态性高、操作简单，现已被广泛应用于多种植物的遗传多样性研究[8-12]。本研究通过筛选ISSR分子标记，对薏苡种质遗传多样性和亲缘关系进行分析，以期为薏苡优异资源的挖掘、品种改良和分子鉴定提供理论与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试薏苡种质材料共92份，其中，86份来自我国贵州、云南、福建等省份，5份来自老挝，1份来自韩国，详见表1。

1.2 DNA提取

取薏苡饱满籽粒，采用苗盘育苗;待生长至3～4叶，采用天根植物新型基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度法检测DNA浓度。

1.3 ISSR扩增

将DNA稀释至30～50 ng/μL再进行扩增。PCR反应总体系为20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，10 μmol/L引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，45～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环;72 ℃延伸5 min。12 ℃保存，1.5%琼脂糖凝胶电泳进行ISSR分型检测，ISSR引物来自网络公布的100条通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 结果调查与数据统计分析

观察琼脂糖凝胶电泳结果，记录每个样品在每个引物位点上条带的有无，同一迁移位置有带的记为1，无带的记为0。采用Ntsys 2.10e软件计算遗传距离矩阵，并分别采用非加权组平均法（UPGMA法）、主成分分析（PCA）对亲缘关系进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物的筛选和扩增条带多态性

选取编号为71、72的样品采用100条通用ISSR引物进行DNA扩增，由表2可见，共筛选得到11对多态性引物、49条多态性条带，引物最佳退火温度（Tm）在48～55 ℃之间;11对引物中每对引物的总扩增条带数为3～10个，多态性条带为3～8个，多态性条带占比在66.7%～100.0%之间，其中，808、809、810、811、814、836、840、842、864这9对引物的多态性条带占比为100.0%（图1）。此外，从扩增效果看，筛选出的引物基序分别为（AG）n、（GA）n、（CT）n、（ATG）n，其中以（AG）n、（GA）n重复基序为主，这从侧面反映出薏苡基因组AG、GA重复序列比较丰富，为下一步利用ISSR开发定向薏苡SSR标记创造了条件。

2.2 薏苡种质聚类分析

2.2.1 非加权组平均法（UPGMA） 由表3、图2可见，以相似性系数0.57为标准，可将92份薏苡种质划分为2个大类3个类群;第Ⅰ大类包含2个亚类，即Ⅰ-1亚类、Ⅰ-2亚类，第Ⅰ-1亚类共48份，占供试种质的52.17%，分别为我国云南15份、贵州13份、福建5份、湖南4份、河北2份、辽宁2份、浙江1份、江苏1份、其他1份，老挝4份;第Ⅰ-2亚类共8份资源，占供试种质的8.70%，均来自我国，其中云南6份、贵州2份;第Ⅱ类共36份资源，占供试种质的39.13%，分别为我国云南8份、贵州9份、四川3份、福建3份、河北2份、山西2份、浙江1份、江苏1份、山东1份、北京1份、其他3份，老挝、韩国各1份。从聚类结果整体来看，云南、贵州、福建3个省份的种质表现出较为丰富的遗传多样性，其他国家或地区的多样性水平相对较低，这可能与不同地区供试种质数目的多少也有一定关系。

2.2.2 主成分分析法（PCA） 通过对92份薏苡种质进行主成分分析（PCA），结果表明，第一、第二主成分值分别为 13.73、3.28，贡献率分别为34.12%、8.16%，前2个主成分的累积贡献率为42.28%，并可将92份薏苡种质聚类分为A、B、C这3个类群（图3）。主成分分析与UPGMA法聚类分析的结果基本一致，相比之下，类群A、B和Ⅰ-1、Ⅰ-2类群基本吻合，且2个类群的发散方向比较一致，均汇集成一个大类;类群C与类群A、B有不同的发散方向，且离远点的距离较远，因此，C类群与其他2个类群相比，具有更高的遗传异质性。

3 结论与讨论

种质资源遗传多样性评价是育种的基础。ISSR标记属显性标记，具有多态性高、在不同作物中通用性强的优势，被广泛用于多种作物的品种鉴定及遗传多样性分析评价中，特别是适用于没有参考基因组序列信息的物种。汪斌等利用ISSR标记结合SRAP、SSR标记，绘制了红麻、黄麻的DNA指纹图谱用于不同品种的分子识别[12-13];马红勃等采用筛选的68个ISSR和SRAP标记，构建了187个单株的F2连锁遗传图谱，可用于烟草重要农艺性状的基因定位和分子辅助选择[14];李本英等筛选出18个ISSR标记，分析了18个种群134份云南茶树种质的亲缘关系和多样性，全部材料间的相似系数为0.445～0.819，平均为0.512[15];李超等利用ISSR标记技术，分析163份新疆核桃种质的遗传多样性和遗传结构时发现，居群间的遗传距离与居群的地理距离之间具有较高的相关性[16];雒新艳等利用ISSR标记探讨了5个瓣类大菊品种的遗传多样性、分化程度和亲缘关系[17];刘娟等则利用ISSR标记遗传距离结合不同取样策略，构建了新疆野杏的核心种质[18]。夏发刚等利用16对SRAP引物初步构建了73份薏苡种质资源的DNA指纹图谱，为薏苡遗传研究、品种选育与资源保护提供了一定依据，但是在更多资源的指纹鉴定中却力有未逮[19]。本研究从100对ISSR通用引物中筛选出11对多态性引物，可较好地划分92份薏苡种质，在薏苡基因组信息未公布而分子标记相对缺乏的前提下，可用作薏苡分子指纹鉴定和遗传多样性研究的重要候选标记，并与有限的SRAP、SSR标记联合使用，用于薏苡的遗传分析。

一直以来，非加权组平均法（UPGMA法）聚类分析是遗传多样性、亲缘关系分析的重要方法，而主成分分析在研究物种亲缘关系、不同种群的地理生态分布等方面有所应用。聚类分析提供了丰富的数量信息，能够量化地表现出不同种质间的关系[20];而主成分分析则从不同的方向和层面提供更多个体或居群之间的信息，能够直观、形象地描述种质资源或居群间的来源（或遗传）差异[21]。有研究表明，种质资源个体或居群间的亲缘关系往往和地理分布有一定的关联性[22]，但也有例外，本研究将92份薏苡种质划分为3类，但并不是来自同一地区的种质都聚在一起，如编号为75、76、77、78的样品和编号为74、79、80的样品均为福建来源种质，却分别聚为2个类群，亲缘关系和地理来源之间并未表現出明显的关联性，这可能与取样的不均衡性和标记数量较少有关。张大乐等以聚类和主成分分析方法揭示了12个啤酒大麦品种的遗传背景差异[23];宋烨等采用12对SSR引物，通过聚类和主成分分析将20个苹果品种划分为4个类群，比较准确地反映了不同苹果品种的亲缘关系和加工品质特点[24]。本研究通过非加权组平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）对92份薏苡种质进行聚类分析，均分为3个类群，聚类结果基本一致，与前人的研究结论[23-24]相似。UPGMA聚类和主成分分析在遗传关系聚类分析方面各有所长，可结合2种分析方法互为印证、补充，更准确地判断不同个体或居群间的遗传关系。

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