miR-4286调控FOXO4对肺癌细胞增殖和转移的影响

何智慧 黄丽 苏菊红 刘峰

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球肺癌的发病率和病死率均呈上升态势，尤其在中国等发展中国家[1,2]。晚期肺癌传统化疗的疗效有限，预后仍不容乐观，中位生存时间仅为8～10个月，1年生存率仅在40%左右[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，可在转录后水平与靶基因的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)结合，抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA，进而调控靶基因的表达，参与多种疾病的发生发展[4]。miR-4286位于人染色体8p23.1位点，已有研究证明miR-4286参与食管鳞癌[5]和胰腺癌[6]的调节。在肺癌细胞中miR-4286呈高表达，其高表达与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期相关[7]。FOXO转录因子是叉头框(Forkhead box,FOX)家族中的一员，通过调节靶基因的转录，参与调控细胞周期、凋亡、分化等过程[8]。FOXO4是FOXO亚家族中的成员，在胃癌、大肠癌中的表达都有所下调或缺失，表明多种机制导致的FOXO4失活可能促进了肿瘤的发生发展[9,10]。本研究通过观察miR-4286在肺癌细胞中的表达及其是否通过调控FOXO4表达影响肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以期为肺癌细胞的靶向分子治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂 人肺癌细胞系A549和人正常支气管上皮细胞系HBE(美国ATCC)；DMEM培养基、MTT试剂(美国Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素混合液(美国Abcam公司)；LipofectamineTM 2000转染试剂(美国Intvitrogen公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)；WT-FOXO4和MUT-FOXO4荧光素酶重组载体质粒(上海生工生物工程有限公司)；荧光素酶报告检测试剂盒(美国Promega公司)；FOXO4过表达重组载体质粒及空载质粒(北京赛百盛基因技术有限公司)；CyclinD1、P21、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9单抗及HRP标记的二抗(英国Abcam公司)；Transwell小室(美国Coring公司)；细胞裂解液、BCA试剂盒、超敏ECL发光试剂(碧云天生物技术研究所)。

1.2 细胞培养 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液培养A549细胞，放置在37℃、饱和湿度、5% CO2细胞培养箱中常规培养。每2天换液，待细胞生长汇合率至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取指数增殖期的细胞用于实验研究。

1.3 细胞转染 生长状态良好的肺癌A549细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞汇合度达50%时，使用LipofectamineTM 2000转染试剂将anti-miR-4286或阴性对照anti-miR-NC转染至A549细胞，具体步骤参照转染试剂说明书。将转染anti-miR-4286的A549细胞命名为anti-miR-4286组，转染anti-miR-NC的A549细胞命名为anti-miR-NC组，2组A549细胞转染48 h行RT-qPCR检测。

1.4 RT-qPCR实验 收集对数生长期的A549细胞以及转染48 h 2组A549细胞，使用Trizol试剂分别抽提总RNA，纯化RNA，并使用分光光度计检测RNA样品的纯度和丰度。使用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒行qPCR检测，反应体系为：cDNA 2 μl、2×SYBR Green Mix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、ddH2O 6 μl。反应程序为：95℃ 5 min；随后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 10 s循环40次。以U6为内参检测细胞中miR-4286的表达水平，以GAPDH为内参检测细胞中FOXO4的表达水平。所用引物序列：miR-4286上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGACCCCACTCCT-3’；下游引物5’-TACCAGGAGTGGGGTTT-3’。U6上游引物5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’；下游引物5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。 FOXO4上游引物：5’-CCGGCAAAAGCTCTTGGTG-3’；下游引物5’-GGTCCACATATCGGCTTCTTCA-3’。 GADPH上游引物5’-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3’；下游引物5’-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3’。反应结束后分别获得目的基因和内参基因的Ct值，采用相对定量2-ΔΔCt法进行分析。实验独立重复3次。

1.5 MTT实验 对数期的A549细胞接种到96孔板中，待细胞汇合率至50%时按照1.3进行转染，anti-miR-NC组、anti-miR-4286组A549细胞转染48 h时，向每孔细胞加入20 μl MTT溶液，随后放置在37℃培养箱常规培养4 h，取出细胞培养板，吸取细胞上清液，再加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀后放置到震荡仪上反应10 min，使用酶标仪测定各孔吸光度值(A值)，分别计算三组A549细胞存活率，细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。实验独立重复3次。

1.6 Transwell实验 转染后3组A549细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，用不含血清的培养液重悬细胞，饥饿处理24 h，将细胞浓度调整为2×105个/ml，取200 μl细胞悬液接种到Matrigel胶预先包被的Transwell小室的上室，在小室下层添加500 μl含10%血清的培养液，放置在37℃常规培养箱继续孵育48 h。取出小室，用湿润的棉签擦去上层未穿过基底膜的细胞，用多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察并计数，实验重复3次，统计3组A549细胞穿膜细胞数目。

1.7 Western blot实验 使用细胞裂解液分别提取转染48 h 3组A549细胞总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白样品进行浓度测定并调平。配制10%的SDS-PAGE凝胶，取等量蛋白上样，电泳分离蛋白后转印到PVDF膜上。实验5%脱脂奶粉室温封阻2 h，洗膜并加入相应一抗，根据说明书将CyclinD1、P21一抗1∶600稀释，MMP-2和MMP-9一抗1∶800稀释，4 ℃过夜孵育。第2天洗膜后再加入1∶2 000稀释的二抗，室温孵育1.5 h，洗膜后滴加超敏ECL显色液，在暗室显影曝光，采集图像，使用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，实验重复3次。

1.8 荧光素酶报告实验 生物信息学软件预测显示，FOXO4的3’UTR与miR-4286的核苷酸序列存在连续结合位点。PCR扩增含miR-4286结合位点的FOXO4的3’UTR序列，插入pmirGLO报告基因载体，构建FOXO4野生型载体(WT-FOXO4)。基因突变技术将结合位点突变后，同样插入pmirGLO报告基因载体，构建FOXO4突变型载体(MUT-FOXO4)。分别将WT-FOXO4、MUT-FOXO4与miR-4286(模拟物)mimic或阴性对照共转染至肺癌细胞。转染24 h后，收集细胞，参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性。实验独立重复3次。

2 结果

2.1 miR-4286和FOXO4在肺癌细胞中的表达 与正常支气管上皮细胞HBE组比较，肺癌细胞A549组中miR-4286表达水平显著升高(P<0.05)，FOXO4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 miR-4286和FOXO4在肺癌组织中的表达

2.2 抑制miR-4286对肺癌细胞增殖的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-4286组miR-4286表达、细胞存活率和CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05)，P21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1,表2。

图1 增殖相关蛋白

表2 抑制miR-4286对肺癌细胞增殖的影响

2.3 抑制miR-4286对肺癌细胞迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-4286组细胞迁移和侵袭数、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表3,图2。

表3 抑制miR-4286对肺癌细胞迁移、侵袭的影响

图2 迁移和侵袭相关蛋白

2.4 上调FOXO4对肺癌细胞增殖的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-FOXO4组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05)，FOXO4 mRNA和P21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表4,图3。

图3 增殖相关蛋白

表4 上调FOXO4对肺癌细胞增殖的影响

2.5 上调FOXO4对肺癌细胞迁移、侵袭的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-FOXO4组细胞迁移和侵袭数、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4,表5。

表5 上调FOXO4对肺癌细胞迁移、侵袭的影响

图4 迁移和侵袭相关蛋白

2.6 miR-4286靶向FOXO4 生物信息学软件预测显示，FOXO4的3’UTR含有与miR-4286结合的连续位点。与miR-NC组比较，miR-4286组共转染WT-FOXO4的细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，而共转染MUT-FOXO4的细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，说明miR-4286可与FOXO4的3’UTR靶向结合。miR-4286组FOXO4的mRNA表达水平低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-4286组FOXO4的mRNA表达水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)，进一步说明miR-4286靶向负调控FOXO4表达。见图5，表6、7。

图5 miR-4286靶向调控FOXO4

表6 双荧光素酶报告实验

表7 miR-4286调控FOXO4的表达

2.7 抑制FOXO4能逆转干扰miR-4286对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与anti-miR-4286+si-NC组比较，anti-miR-4286+si-FOXO4组细胞存活率、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)，FOXO4 mRNA、P21蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图6，表8。

表8 抑制FOXO4能逆转干扰miR-4286对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图6 增殖、迁移和侵袭相关蛋白

3 讨论

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内已居恶性肿瘤类疾病的第1位[11]，而在我国恶性肿瘤疾病的死亡原因中也居首位，约占到全部恶性肿瘤病死率的22.7%，并且其发病率正以每年26.9% 的速度增长，如果不能进行有效的控制，预计到2025年，我国将成为世界第一肺癌大国[12]，因此研究肺癌的治疗方案是当今亟待解决的难题。

miR-4286早前已经被证实在肿瘤发生进展过程中起到重要作用。赵华等[13]研究发现，miR-4286在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达显著高于癌旁正常组织。miR-4286 的阳性染色定位于NSCLC癌组织、癌旁正常组织的胞质或细胞核，染色呈红色至深紫色。赵琳等[14]研究表明，miR-4286在前列腺癌中具有良好的诊断价值，可作为新型的液体活检标志物。

据郭红艳等[15]报道，miR-4286在胃癌血清中高表达，其表达水平与病理分化程度有关，可能成为胃癌临床诊断的潜在指标。miR-4286 通过靶向INPP4A基因激活JAK2/STAT3信号通路，促进食管癌的发生，与食管癌患者的预后生存期高风险密切相关，有望成为食管癌治疗的靶点[16,17]。本研究表明，miR-4286在肺癌中的表达比较高。

已知作为抑癌基因的FOXO4，不仅参与阻滞肿瘤细胞周期，还通过多种途径参与细胞凋亡过程。已经有研究表明，FOXO4在NSCLC中低表达，其可作为抑癌基因[18]；miR-96介导FOXO3表达变化促进肺腺癌细胞凋亡并抑制肺癌细胞增殖[19]。FOXO4在胃癌中的增殖、凋亡、感染关系和预后关系中发挥重要作用[20-23]；FOXO4在大肠癌中表达明显降低或缺失，且在大肠癌的发生发展过程中起到抑癌基因的作用[24]；通过研究发现FOXO4蛋白在结肠直肠组织中的差异表达，癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁组织，差异具有统计学意义[25]；FOXO4能够促进人喉癌细胞凋亡，抑制喉癌细胞增殖，作用机制与Wnt/β-catenin信号通路有关[26]；miR-421下调FOXO4可以增强鼻咽癌细胞CNE-2的放疗敏感性[27]。本研究表明，FOXO4在肺癌中的表达比较低。

综上所述，miR-4286在肺癌细胞中呈高表达，抑制其表达可降低肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其通过靶向下调FOXO4表达发挥作用，miR-4286/FOXO4轴为肺癌的靶向分子治疗提供了新思路。