甲状腺癌患者microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的表达与临床特征及预后的相关性

孙睦 赵俊英 孙振刚 杨帅 牛万锦 李俊峰

甲状腺癌是一种常见内分泌肿瘤，且近年来患病率持续增加[1]。上述这个过程每个步骤均涉及1个或多个基因改变，这个过程>10年。甲状腺癌与甲状腺良性结节的临床表现、疗效、生存期具有很大差异，其中细胞遗传学异常与患者的预后显著相关[2]。为此找到诊断治疗甲状腺癌的新靶点，寻求更简单、有效的诊疗方式，对改善患者预后具有重要价值[3]。MicroRNA(miRNA)是一类单链小RNA，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用，microrna-675已被发现可参与多种重要生命过程，在前列腺癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌中呈现异常表达谱情况[4,5]。长链非编码RNAs(LncRNAs，long non-coding RNAs)为不具备编码蛋白能力的RNA。LncRNAs具有明显的时空表达特异性，可调控蛋白编码基因的表达水平[6]。Actinin-4作为actin绑定蛋白，与细胞能动性和肿瘤的入侵、迁移密切相关。人类恶性肿瘤发展过程中，Actinin-4蛋白水平显著升高，并且与肿瘤的不良预后相关[7],但其与甲状腺癌的关系鲜有报道。胰岛素样生长因子1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)在多种恶性肿瘤发病模型中起重要作用，其中IGF-R1在人甲状腺癌细胞内也过表达。IGF-1R特异性抑制剂(中和抗体、拮抗肽或激酶抑制剂NVP-ADW742)可以抑制多种肿瘤细胞生长[8]。本文具体探讨了甲状腺癌患者microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的表达与临床特征及预后的相关性，以明确甲状腺癌的发生机制，为改善患者预后提供参考。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2019年3月确诊为甲状腺癌患者78例(甲状腺癌组)与甲状腺良性结节患者78例(良性组)。甲状腺癌组：甲状腺乳头状癌54例，滤泡性癌20例，髓样癌4例；临床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期25例，Ⅲ期18例；组织学分化：低分化22例，中高分化56例；发病位置：左侧36例，右侧42例；远端转移36例。良性组：结节性甲状腺肿60例，甲状腺腺瘤18例。本研究得到了所有患者的知情同意，也取得了本院伦理委员会的批准书。2组患者资料等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组一般资料比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：甲状腺癌与甲状腺良性结节都经过病理确诊；临床资料完整；年龄30～70岁；有相对完整的临床及病理资料；均未进行治疗的初诊患者。

1.2.2 排除标准：妊娠期及哺乳期女性；患有淋巴瘤等其他恶性肿瘤及严重免疫缺陷患者；合并糖尿病患者；临床资料缺乏者；不配合调查者；合并精神障碍的患者；伴有出血性疾病、出血倾向；精神系统疾病或长期心理压力过大患者。

1.3 microrna-675、LncRNA LUCAT1表达检测 采集所有患者的空腹静脉血3～5 ml，分为2管。其中一管抗凝后室温放置2 h，取下层全血组织，分离外周血单个核细胞。提取总RNA，采用PrimerScript RT Reagent试剂盒(Takala)将RNA逆转录为cDNA，然后采用定量PCR检测试剂盒(taqman real-time PCR assays，德国Qiagen)检测microrna-675、LncRNA LUCAT1表达水平。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火25 s，40个循环，4℃保存。实验结果采用相对定量法ΔΔCT进行分析，计算2-ΔΔCT，检测全血microrna-675、LncRNA LUCAT1相对表达水平。

1.4 Actinin-4、IGF-1R表达检测 取1.2中的另一管血液样本，不进行抗凝，室温放置2 h后3 000 r/min离心10 min(离心半径为10 cm)，分离上层血清在-80℃冰箱保存。采用酶联免疫法检测血清Actinin-4、IGF-1R含量，检测试剂盒都由上海生工公司提供。

1.5 临床资料与预后调查 调查所有患者的一般资料，详细调查甲状腺癌患者的病理资料，包括病理类型、临床分期、组织学分化、发病位置、远端转移等。同时随访到2020年1月1日，记录所有患者的生存情况。

2 结果

2.1 microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平比较 甲状腺癌组microrna-675、LncRNA LUCAT1相对表达水平和血清IGF-1R值低于良性组，血清Actinin-4值高于良性组(P<0.05)。见表2。

表2 2组microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平比较

2.2 预后情况比较 随访到2020年1月1日，良性

组患者都存活；甲状腺癌组中存活67例，存活率85.9%，比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3 诊断价值分析 在156例患者中，ROC曲线分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鉴别诊断甲状腺癌的AUC值分别为0.843、0.807、0.811和0.837。

2.4 相关性分析 在甲状腺癌患者中，Pearson分析显示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平与临床分期、组织学分化、远端转移、预后都存在相关性(P<0.05)。见表4。

2.5 影响因素分析 在甲状腺癌患者中，以患者的随访生存作为因变量，以临床分期、组织学分化、远端转移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平等作为自变量，多因素Logistic回归分析显示临床分期、组织学分化、远端转移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平都为影响患者预后的主要因素(P<0.05)。见表5。

3 讨论

已有研究显示甲状腺癌发病率逐年增加不仅是因为过渡诊断，还与一些风险因素相关，如胰岛素抵抗、环境致癌物和有限的治疗手段[9]，这些因素对甲状腺癌的发生发展至关重要。甲状腺癌预后较好，5年存活率>90%，但是严重影响患者的生存质量，增加了生活压力。目前，临床主要依靠超声、病理学等手段诊断，存在一定程度的漏诊及误诊[10]。

甲状腺癌的发生发展是多因素、多阶段，多种癌基因相互作用的复杂过程，但是具体机制还不明确。本研究显示甲状腺癌组的microrna-675、LncRNA LUCAT1相对表达水平和血清IGF-1R值低于良性组，血清Actinin-4值高于良性组，差异有统计学意义(P<0.05)。从机制上分析，作为一类非编码RNAs，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用，可调控细胞增殖、黏附、凋亡等重要过程，研究表明H19RNA通过提供miR-675，结合与CDH13基因，阻断CDH13表达，进而促进甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力[11]。LncRNA可在表观遗传学水平、转录及转录后水平等调控基因的表达，从而参与肿瘤的增殖、侵袭和转移等病理过程[12]。LUCAT1可以增加MYC蛋白的半寿期，也可影响细胞功能[13]；并且可以与miRNA200家族结合而影响miRNA200家族对靶基因的作用。LUCAT1具有癌基因的特性和潜质，在乳腺癌中表达上调[14]。细胞能动性在肿瘤细胞通过血液或淋巴侵入临近组织或器官时至关重要，此时Actinin-4扮演重要角色。Actinin-4过表达与甲状腺癌等肿瘤的不良预后和化疗抵抗密切相关[15,16]。本研究发现，Actinin-4甲状腺癌患者体内高表达，可能作为甲状腺癌诊断标志物。IGF-1R在很多肿瘤中普遍表达，特异性抑制IGF-1R的功能(如选择性小分子酪氨酸酶抑制剂)，可起到抗癌作用。甲状腺癌细胞系和原发肿瘤样本对IGF-1R抑制剂非常敏感。通过转录组和蛋白质组学分析发现，抑制IGF-1R具有抑制增殖和促进凋亡的多效性[17]。

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，随着经济飞速发展、生活方式改变、社会人口老龄化等问题，该病在我国的发生率逐年增加[18]。肿瘤相关信号通路调节异常、表观遗传学修饰等因素均参与了甲状腺癌的发生发展过程[19]。本研究显示随访到2020年1月1日，良性组患者都存活；甲状腺癌组中存活67例，存活率85.9%，差异有统计学意义(P<0.05)；在156例患者中，ROC曲线分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鉴别诊断甲状腺癌的AUC值分别为0.843、0.807、0.811和0.837。

当前随着城市化进程的加快，甲状腺癌的发病率显著升高。不过该病的增殖与侵袭是1个多步骤、多因素相互作用的复杂过程，具体的机制尚不清楚，明确甲状腺癌的转移与侵袭机制是当前研究领域的热点[20]。基因异常和环境因素对甲状腺癌的影响已经被广泛研究，但是疾病进展过程中所包含的分子机制并不明确。大量miRNAs作为原癌基因或抑癌基因，参与了肿瘤的恶性发展进程[21]。本研究Pearson分析显示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平与临床分期、组织学分化、远端转移、预后都存在相关性(P<0.05)；多因素Logistic回归分析显示临床分期、组织学分化、远端转移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表达水平都为影响患者预后的主要因素(P<0.05)。LUCAT1位于8号染色体长臂2区4带，其位于MYC原癌基因3端60 KB的位置，不过LUCAT1和MYC对一些疾病的发生可发挥独立的作用[22]。有学者发现microrna-675、在甲状腺癌细胞系中表达降低，过表达microrna-675后可以抑制细胞活性、迁移和入侵能力，结果表明microrna-675作为肿瘤抑制因子，可调节甲状腺癌发生发展进程[23,24]。不过本研究也有一定的不足，没有进行临床分析与实验动物模型分析，并没有系统筛选LUCAT1可能作用的蛋白质，实验数据收集存在差异，可能也会影响结果的准确性，存在一定的研究偏倚，将在后续研究中深入分析。

综上所述，甲状腺癌患者伴随有microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的影响表达，与患者的临床特征显著相关，可用于鉴别诊断甲状腺癌，且都是影响患者预后的重要因素。