黄连调控miR-26a-3p对急性胰腺炎胰腺细胞增殖和凋亡的影响

曾小华 廖辉军 刘柏京 乐冬友

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种以胰腺局部炎症和全身炎性反应为特征的急性炎症性疾病，根据严重程度的不同，可将AP分为轻症、中症和重症AP[1]。轻症AP最为常见，预后较佳，但是重症AP病情多变，常伴有胰腺组织坏死及脏器功能衰竭，严重时可致死[2]。AP的发生发展过程复杂，涉及多个阶段和多种基因的调控。研究表明，胰腺腺泡细胞的增殖和凋亡与AP的严重程度密切相关[3]。目前，AP缺乏有效的治疗手段。因此，探究影响胰腺腺泡细胞增殖和凋亡的分子机制并寻找有效的治疗方法具有重要意义。黄连是常用中药，味甘性寒，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种功效[4]，但黄连对胰腺腺泡细胞增殖和凋亡的影响及分子机制还未见相关报道。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码RNA，参与炎性和免疫疾病、肿瘤、心血管疾病等多种疾病的发生发展[5-7]。研究显示，miR-26-3p在重症AP中患者血浆中表达降低[8]，但其对胰腺腺泡细胞增殖和凋亡的影响也还未知。本研究利用雨蛙素作用AR42J细胞建立AP细胞模型，探讨了黄连提取物对雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞增殖和凋亡的影响及其能否通过调控miR-26-3p表达发挥作用，以期为AP的治疗及分子机制的阐明提供一定的新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验试剂 大鼠胰腺腺泡AR42J细胞细胞(中国科学院上海细胞库)，黄连饮片(合肥乐家铺中药饮片有限公司)，雨蛙素、四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)和RPMI 1640培养基(美国Hycolne公司)，LipofectamineTM 2000试剂盒和Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，兔抗大鼠P21、半胱天冬酶-3(Caspases-3)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗大鼠髓系细胞触发受体1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM1)单克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 黄连水提物制备：参照文献方法[9]制备黄连水提物。黄连饮片干燥后称重，粉碎后，加5倍体积蒸馏水浸泡1 h，水浴2 h，离心。滤渣再加3倍体积蒸馏水，水浴提取1 h，离心。将2次滤液合并，减压浓缩后冷冻干燥。冻干粉溶于灭菌的去离子水中，0.22 μm过滤，配置1 g/ml的母液，使用时培养基稀释。

1.2.2 细胞培养和转染：复苏AR42J细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养基置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。每隔2天更换1次培养基。当细胞融合至80%～90%时，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，传代培养。以每孔1×105个AR42J细胞接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，更换无血清培养基。参照LipofectamineTM 2000试剂盒操作说明，将miR-26a-3p 模拟物mimcs(miR-26a-3p组)及阴性对照序列(miR-NC组)、miR-26a-3p抑制剂(anti-miR-26a-3p组)及阴性对照序列(anti-miR-NC组)TREM1过表达载体(pcDNA3.0-TREM1组)及阴性对照序列(pcDNA3.1组)分别转染至AR42J细胞。转染24 h后，更换培养基，继续培养至48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞分组：①未转染的AR42J细胞分为对照组：正常培养；雨蛙素组：含10-8 mol/L[10]雨蛙素的培养基培养8 h；雨蛙素+黄连-L组：含10-8mol/L雨蛙素与2.5 mg/ml[9]黄连的培养基共同培养8 h；雨蛙素+黄连-M组：含10-8mol/L雨蛙素与5.0 mg/ml黄连的培养基共同培养8 h；雨蛙素+黄连-H组：含10-8mol/L雨蛙素与10.0 mg/ml黄连的培养基共同培养8 h。②miR-26a-3p组、miR-NC组AR42J细胞均采用含10-8mol/L雨蛙素的培养基培养8 h，分别记为雨蛙素+miR-26a-3p组、雨蛙素+miR-NC组。③anti-miR-26a-3p组、anti-miR-NC组、pcDNA3.1-TREM1组、pcDNA3.1组AR42J细胞均采用含10-8mol/L雨蛙素与100 mg/ml黄连的培养基共同培养8 h，分别记为雨蛙素+黄连-H+anti-miR-26a-3p组、雨蛙素+黄连-H+aanti-miR-NC组、雨蛙素+黄连-H+pcDNA3.1-TREM1组、雨蛙素+黄连-H+pcDNA3.1组。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中IL-6和TNF-α水平：AR42J细胞以每孔2.5×104个接种于24孔板中。细胞贴壁后，按照1.2.3分组处理。培养结束后，收集细胞培养上清液。3 500 r/min离心5 min，分别参照IL-6和TNF-α试剂盒说明书检测上清中IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 MTT检测细胞增殖：AR42J细胞以每孔5×103个接种于96孔板中。细胞贴壁后，按照1.2.3分组处理。培养结束后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，培养箱中继续孵育4 h。吸弃培养基，每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度值(absorbance，A)。细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：AR42J细胞以每孔2.5×104个接种于24孔板中。细胞贴壁后，按照1.2.3分组处理。培养结束后，吸弃培养基，加入适量预冷的PBS清洗细胞，吸弃PBS。加入胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，加入400 μl结合缓冲液，轻轻吹打混悬细胞后，加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。然后加入5 μl PI，室温避光孵育5 min。最后再加入100 μl结合缓冲液，涡旋混匀后上流式细胞仪检测。

1.2.7 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测细胞中miR-26a-3p和TREM1 mRNA表达水平：收集各组细胞，PBS清洗后，加入Trizol试剂提取细胞中总RNA。微量核酸仪检测RNA的浓度进行定量后，参照逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，行PCR扩增。扩增条件：95℃10 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共进行35个循环。引物序列：miR-26a-3p上游5’-GTAGCGCGATGCCGAACGTG-3’，下游5’-GCGTGAACGGCCGTGACG-3’；TREM1上游5’-CGTGTGAAACGCTGCAGAGC-3’；下游5’-CAGGCTGCGTGAAGAACGT-3’；U6上游5’-GAACGTGCCGGGCGTGCAG-3’，下游5’-GGTGAACGCCGTGGACGCC-3’；GAPDH上游5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游5’-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3’。miR-26a-3p以U6为内参，TREM1以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-26a-3p和TREM1 mRNA的相对表达水平。

1.2.8 蛋白印迹(Western Blot)法检测细胞中P21、Caspases-3和TREM1蛋白表达水平：收集各组细胞，PBS清洗后，加入RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度对蛋白定量后，取适量蛋白溶液，100 ℃煮沸5 min。蛋白变性后行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔蛋白上样量30 μg。电泳后，湿转至聚偏乙烯二氟膜，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h。分别加入P21(稀释比1∶600)、Caspases-3(稀释比1∶400)、TREM1(稀释比1∶400)抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(稀释比1∶200)，37℃孵育1 h。加入ELC显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.9 双荧光素酶报告基因实验验证miR-26a-3p和TREM1靶向关系：生物信息学软件预测显示，TREM1的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)存在与miR-26a-3p结合的核苷酸序列。PCR扩增含miR-26a-3p结合位点的TREM1的3’UTR序列，构建TREM1野生型质粒(WT-TREM1)。并利用基因定点突变技术将结合位点突变，构建TREM1突变型质粒(MUT-TREM1)。AR42J细胞接种于6孔板中，融合至60%时，分别共转染TREM1-WT、TREM1-MUT与miR-26a-3p mimic、阴性对照。转染24 h后，收集细胞，检测各组荧光素酶活性。具体操作参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，结果以荧光虫活性/海肾荧光强度比值表示。

2 结果

2.1 黄连提取物对AP细胞中IL-6和TNF-α表达的影响 与对照组比较，雨蛙素组AR42J细胞IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。与雨蛙素组比较，雨蛙素+黄连-L组、雨蛙素+黄连-M组和雨蛙素+黄连-H组AR42J细胞IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 黄连提取物对AP细胞中miR-26a-3p、IL-6、TNF-α表达的影响

2.2 黄连提取物对AP细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，雨蛙素组AR42J细胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。与雨蛙素组比较，雨蛙素+黄连-L组、雨蛙素+黄连-M组和雨蛙素+黄连-H组AR42J细胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。见表2，图1、2。

表2 黄连提取物对AP细胞增殖、凋亡的影响

图1 黄连提取物对AP细胞凋亡的影响

图2 黄连提取物对急性胰腺炎细胞增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.3 黄连提取物对急性胰腺炎细胞miR-26a-3p表达的影响 与对照组比较，雨蛙素组AR42J细胞miR-26a-3p水平降低(P<0.05)。与雨蛙素组比较，雨蛙素+黄连-L组、雨蛙素+黄连-M组和雨蛙素+黄连-H组AR42J细胞miR-26a-3p水平升高(P<0.05)。见表3。

2.4 过表达miR-26a-3p对急性胰腺炎细胞增殖、凋亡及IL-6和TNF-α表达的影响 与雨蛙素+miR-NC组比较，雨蛙素+miR-26a-3p组AR42J细胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。见图3、4，表3。

图3 过表达miR-26a-3p对急性胰腺炎细胞凋亡的影响

图4 过表达miR-26a-3p对急性胰腺炎细胞增殖凋亡蛋白表达的影响

表3 过表达miR-26a-3p对急性胰腺炎细胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表达的影响

2.5 抑制miR-26a-3p能逆转黄连提取物对AP细胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表达的影响 与雨蛙素+黄连-H+anti-miR-NC组比较，雨蛙素+黄连-H+anti-miR-26a-3p组AR42J细胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。见图5、6,表4。

表4 抑制miR-26a-3p能逆转黄连提取物对AP细胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表达的影响

图5 抑制miR-26a-3p能逆转黄连提取物对急性胰腺炎细胞凋亡的影响

2.6 miR-26a-3p靶向调控TREM1的表达 生物信息学软件预测显示，TREM1的3’UTR存在与miR-26a-3p结合的连续位点。与miR-NC组比较，miR-26a-3p组共转染WT-TREM1的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而共转染MUT-TREM1的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。miR-26a-3p组TREM1 mRNA水平低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-26a-3p组TREM1 mRNA水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)。这说明miR-26a-3p靶向负调控TREM1的表达。见图7，表5、6。

图6 抑制miR-26a-3p能逆转黄连提取物对急性胰腺炎细胞增殖凋亡蛋白表达的影响

图7 miR-26a-3p靶向TREM1

表5 双荧光素酶报告实验

表6 miR-26a-3p调控TREM1的表达

2.7 过表达TREM1能逆转黄连提取物对急性胰腺炎细胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表达的影响 与雨蛙素+黄连-H+pcDNA3.1组比较，雨蛙素+黄连-H+pcDNA3.1-TREM1组AR42J细胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。见图8、9,表7。

图8 过表达TREM1能逆转黄连提取物对急性胰腺炎细胞凋亡的影响

图9 过表达TREM1能逆转黄连提取物对急性胰腺炎细胞增殖凋亡蛋白表达的影响

表7 过表达TREM1能逆转黄连提取物对AP细胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表达的影响

3 讨论

AR42J细胞来自于大鼠胰腺腺泡细胞瘤，由于其易培养、刺激反应大且转染效率高，常用于AP细胞模型的建立[11]。雨蛙素是一种生物活性多肽，可刺激胆囊收缩及胰酶分泌，促进胰腺腺泡细胞凋亡，损伤组织[12]。本研究显示，雨蛙素处理后，AR42J细胞IL-6和TNF-α分泌水平明显增加，提示模型建立成功。

田立群等[13]研究显示，黄连降脂合剂可抑制动脉粥样硬化(AS)大鼠血管组织细胞间黏附分子-1和核因子-κB的表达，改善AS大鼠血脂水平，发挥抗AS作用。韩春杨等[9]研究显示，黄连水提液可抑制脂多糖诱导的大鼠肝细胞凋亡，减少IL-6和TNF-α等炎性因子的释放，保护肝损伤。本研究显示，黄连提取物可降低雨蛙素诱导的AR42J细胞IL-6和TNF-α分泌，提示黄连提取物可通过降低炎性反应保护胰腺腺泡细胞损伤。细胞的增殖和凋亡在AP发生发展中起重要作用。本研究显示，雨蛙素可降低AR42J细胞活性，并诱导AR42J细胞凋亡，而黄连提取物可抑制受损的AR42J细胞增殖，促进受损的AR42J细胞凋亡。P21是一种细胞生长抑制因子，其表达升高可抑制细胞增殖[14]。Caspase-3是caspase级联反应的关键调控蛋白，参与细胞凋亡，是细胞凋亡执行蛋白[15]。本研究显示，黄连提取物可促进雨蛙素诱导的AR42J细胞P21和Caspase-3蛋白表达，提示黄连提取物通过调控P21和Caspase-3蛋白表达影响雨蛙素诱导的AR42J细胞增殖和凋亡。

AP的发生发展受到miRNA的调控。如王晓华等[16]研究显示，miR-181a-5p表达通过靶向上调PIAS1表达降低TNF-α和IL-6表达及细胞凋亡，参与AP的发病过程。目前研究表明，miR-26-3p在重症急性胰腺炎中患者血浆中表达降低，但其对胰腺腺泡细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究显示，雨蛙素可降低AR42J细胞中miR-26-3p表达水平，而黄连提取物可提高雨蛙素诱导的AR42J细胞中miR-26-3p表达，提示miR-26-3p参与AP发生发展，且黄连提取物可能通过调控miR-26-3p表达影响AR42J细胞的增殖和凋亡。通过转染miR-26-3p mimics至AR42J细胞，结果显示，过表达miR-26-3p可抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞增殖，并促进细胞凋亡，而抑制miR-26-3p表达降低了黄连提取物对雨蛙素诱导的AR42J细胞增殖和凋亡及炎性因子IL-6和TNF-α的分泌，进一步说明了黄连提取物通过上调细胞中miR-26-3p表达影响雨蛙素诱导的AR42J细胞增殖、凋亡和炎性反应。

双荧光素酶活性及RT-qPCR检测证实了miR-26-3p在AR42J细胞中靶向负调控TREM1表达。TREM1属于免疫球蛋白超家族受体，介导炎性反应，可促进单核细胞、巨噬细胞中TNF-α和IL-1的表达[17]。研究显示，重症AP大鼠胰腺组织TREM-1表达显著增加，且和疾病严重程度相关，TREM-1在重症AP发生发展过程中发挥重要作用[18]。本研究显示，过表达TREM1后，黄连提取物对雨蛙素诱导的AR42J细胞增殖、凋亡和炎性因子IL-6和TNF-α分泌的影响降低，进一步表明黄连提取物通过上调miR-26-3p表达，进而下调TREM1表达抑制受损的AR42J细胞，并促进受损细胞凋亡，且降低炎性反应。

综上所述，黄连提取物可抑制受损的AR42J细胞增殖和炎性反应，并促进受损的细胞凋亡，其可能通过上调细胞中miR-26-3p表达，进而下调TREM1表达发挥作用。但本研究尚存在不足之处，仅在细胞层面进行了初步探讨，接下来将通过魔物模型实验进一步深入探讨黄连提取物对AP的治疗作用及作用机制。