α1-抗胰蛋白酶基因3’UTR区功能及与COPD的关系研究

任 杰，李 黎（通讯作者），钟雪梅，郑爱芳，李菲菲，马 涛

（新疆喀什地区第一人民医院呼吸与危重症医学科 新疆 喀什 844000）

1.资料与方法

1.1 细胞培养条件

DMEM+10% FBS，37℃、5% CO2饱和湿度培养

1.2 主要试剂

双荧光素酶报告基因；PCR反应试剂盒，转染试剂盒，定点突变试剂盒，限制性内切酶DNA NotI, XhoI, Taq DNA聚合酶。

1.3 Q-PCR引物设计

用目标基因SNP rs1051052-C设计引物，以所需扩增基因片段DNA为模板建立PCR反应体系，纯化PCR产物；完善质粒扩增与抽提，酶切，连接和转化，将质粒及引物结果与基因库内3'UTR区域序列进行比对验证，见表1。

1.4 双荧光素酶报告基因实验

1.4.1 载体构建 根据PCR扩增片段比对结果，将含有SNP rs1051052-G片段的PCR扩增产物通过限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ进行定点位切后与质粒构建载体HmiT104523-MT06，同时在CE Design Ⅴ1.03网站上设计SNP rs1051052-G定点突变引物，利用定点突变试剂盒进行G→C定点突变，并构建载体CS-HmiT104523-MT05-01。通过双酶切与载体相应区域连接构建靶克隆对照载体CmiT000001-MT05，见表1。

表1 实验所用引物序列

1.4.2 细胞转染 分别将构建好的荧光素酶报告基因载体与双荧光素酶基因结合，以高质量的质粒转染靶细胞，将含有转染细胞的培养液与转染液轻柔混匀，用脂质体法共转染48 h后，用化学发光仪测定荧光素发光度以显示靶标活性。

1.4.3 miRNA干扰 利用snpinfo软件预测SNP rs1051052-G位点潜在结合的miRNA,合成miRNA以及它的抑制剂，并用脂质体法转染，定量检测实验组及对照组不同分组细胞荧光数值，鉴定miRNA作用靶点。

1.4.4 miRNA靶标活性检测 分别检测miRNA及miRNA mimics与报告基因载体的双荧光素酶活性数值，反应对靶标的调控活性，见表2。

表2 Gluc和SEAP表达量及抑制率

2.结果

本实验将miRNA mimics, miRNA mimics阴性对照，靶标克隆对照，3'UTR靶标克隆（野生型），3'UTR靶标克隆（突变型）分别组合，将实验分为六组（A组-F组），以海肾荧光素酶（GLuc）基因作为报告基因，分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因为内参基因，使用荧光素酶检测法检测活性，通过荧光素酶基因与Alpha-1-AT内参照基因拷贝数比值进行相应计算，不同组间报告基因活性的比较采用t检验，结果显示miRNA mimics对野生型靶标的抑制效率约为38.94%（1～27.07%/44.33%），对突变型靶标的抑制率41.93%（1～28.41%/48.92%），抑制效率并无明显差异（P＞0.05），提示SNP rs1051052-G位点靶标位点的突变不显著影响miRNA对靶标的抑制作用。

进一步将3'UTR靶标克隆野生型、3'UTR靶标克隆突变型与对照组分为三组（G组-Ⅰ组）进行检测及对比，结果显示miRNA mimics对靶标克隆野生型及靶标克隆突变型的抑制效率为分别为52.65%（1～47.35%）、53.01%（1～44.99%）（P＜0.05），结果显示可能存在其他内源性物质对野生型靶标及突变型靶标存在明显的抑制作用。

3.讨论

慢性阻塞性肺病是基因多态性和环境因素共同作用的结果[1]，以不完全可逆性气流受限为表现，将成为全球第五位因病死亡原因，社会经济负担重，目前，破译COPD易感位点的功能机制，为临床提供治疗靶点，是目前的研究热点和难点。

在众多基因中，蛋白质编码基因占总基因的比例＜2%[2]，很大一部分被转录成非编码基因，α1-AT基因位于14q32.1，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂，是较为确定的与COPD相关的易感基因[3]，但α1-AT基因3'UTR区域如何调控和影响COPD的发生发展，尚不明确[4]；为进一步明确SNP rs1051052-G位点与miRNA之间的功能关系及如何影响COPD的发生发展，本研究结合相关生物信息学分析以及功能实验进行探究。

3’UTR区域为非编码区，是真核生物基因的重要结构成分，主要功能涉及基因的表达调控，miRNAs是通过相应靶基因与mRNA中3’UTR不完全配对结合在转录后水平负调控基因表达[5]从而影响mRNA的稳定性，导致mRNA的抑制或降解，最终影响基因表达。

不同暴露条件下的COPD患者miRNA存在不均一表达性，有对照研究结果显示，不同组织暴露于烟雾24周后，肺组织中有31个miRNA表达下调，灌洗液中有78个miRNA表达上调[6]。进一步研究发现，吸烟可诱导循环miRNAs的差异表达，miR-149-3p等miRNA的下调可通过调节TLR-4/NF-κB信号通路增加IL-1β和TNF-α的分泌，增强COPD患者的炎症反应[7]。

研究发现维吾尔族人群携带rs1051052-G等位基因可能有较高的COPD患病风险[8]，本研究进一步利用双荧光素酶基因检测，通过miRNA和miRNA抑制剂转染细胞证实比对，明确SNP rs1051052-G位点突变不特定影响相关miRNA对靶标的抑制作用，但本实验的目的靶标存在一定的抑制表现，可能细胞本身存在内源性miRNA或内源性物质对野生型及突变型靶标存在明显的抑制作用，但尚不能确认是哪种或哪几种miRNA起到调控作用，需要进一步实验研究探讨。

综上所述，本研究初步解析了非编码区SNP rs1051052-G调控基因表达的分子机制，完成了靶标位点的功能验证，有助于为进一步了解遗传因素对维吾尔族COPD发病的影响，寻找一些潜在的miRNA生物标志物信息，为提供个体差异的诊断及治疗提供参考。