脂联素水平降低对小鼠卵泡发育的影响

张伟鹏，周道靖，林泽鹏，戴雪娟，柯 亮，谢欣宇，陈志群，程丽宪（通讯作者）

（厦门医学院机能与临床转化福建省高校重点实验室 福建 厦门 361023）

脂联素（adiponectin, APN）是由脂肪细胞分泌的一种重要脂肪因子，有趣的是血清脂联素水平与肥胖呈现负相关关系。脂联素除具有增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用[1]外，与生殖内分泌也息息相关。我国妇女的不孕症发生可能是多方面因素的作用结果。卵源性不孕目前是辅助和非辅助生殖医学界面临的一大难题，其原因可能与原始卵泡激活和卵泡发育过程的信号调控异常会导致早发性卵巢功能不足、卵泡生长迟缓、卵母细胞质量下降、排卵障碍等卵源性不孕事件的发生有关。卵泡在发育的过程中主要受到下丘脑—垂体调控的激素和多种信号通路的作用[2-3]。脂联素主要通过与两种主要的受体AdipoR1和AdipoR2结合发挥多效作用，而且脂联素与其受体在颗粒细胞、卵母细胞和卵泡膜细胞中均有表达[4-5]。研究显示脂联素可能影响卵巢的类固醇生成、卵泡发育和排卵，其基因表达的变化受到与卵泡发育相关激素的影响。而且在接受FSH治疗的妇女，其血清脂联素水平与体内获得的卵母细胞数量呈正相关[6]。这些研究表明，脂联素可能与卵泡的发育成熟和闭锁有关。

事实上，在脂联素调节卵巢功能的潜在作用研究中尚存在一定的分歧。例如通过体外培养的猪颗粒细胞，脂联素可以通过激活MAPK-ERK1/2途径，使卵泡发育和类固醇合成酶相关基因的表达增加[7]。相反，另一项研究认为在黄体生成素存在的情况下，脂联素可以抑制体外牛卵泡膜细胞类固醇的生成[8]。因此，本次研究以脂联素缺失小鼠为模型研究脂联素水平降低对于卵巢卵泡发育成熟的影响，为临床女性不孕提供新的致病基础。

1.资料与方法

1.1 实验动物

实验中所有使用的小鼠均为雌性。脂联素基因缺失小鼠由广东工业大学的赵子建教授惠赠；清洁级C57BL/6小鼠购自福建吴氏动物实验中心，于厦门大学动物实验中心饲养繁殖。厦门医学院医学伦理委员会动物试验伦理审批件（批件号：20190504001）。

1.2 实验试剂

小鼠脂联素血清ELISA试剂盒购自美国Millipore公司，苏木素、伊红购自珠海贝索公司，石蜡购自美国Sigma公司，石蜡块切刀片购自德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠血清脂联素水平鉴定 在2019年6月—2020年11月将健康繁育的20周龄雌性C57BL/6（WT），脂联素缺失杂合（APN+/-）和脂联素缺失纯合（APN-/-）小鼠各组10只，摘眼球取血，并低温分离血清，于-80℃保存样本。对于不同基因型小鼠血清中脂联素的浓度的测定，利用小鼠脂联素ELISA试剂盒说明书上的方法进行。

1.3.2 雌性小鼠生育率评估 健康繁育的8周龄WT,APN+/-和APN-/-雌鼠每种基因型各8只，与健康可育的C57BL/6雄性小鼠交配28周。并记录28周期间每只雌鼠总产仔数。

1.3.3 卵巢苏木精-伊红（HE）染色和连续切片

卵巢固定于4%中性福尔马林中过夜，常规石蜡包埋，于切片机上行厚为5μm的连续切片。间隔10张切片，取一张做HE染色，显微镜下计数每个卵巢所有HE切片中的原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡和闭锁卵泡的数量。卵泡总数包括原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡和闭锁卵泡[9]。计算方式为：各级卵泡所占比例=各级卵泡数目/卵泡数目×100%，上述所有卵泡类型均以卵泡总数的百分比表示。

1.4 统计学方法

运用GraphPadPrism 5.0统计分析，计量资料以表示，组间行t检验。计数资料以n%表示，组间行χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 脂联素缺失小鼠血清脂联素水平降低

利用小鼠血清脂联素ELISA试剂盒分别检测三组小鼠血清脂联素的水平。结果发现WT小鼠血清脂联素水平为（13.37±1.358）ng/mL, APN+/-小鼠血清脂联素浓度（5.481±0.7063）ng/mL约为WT小鼠的50%，而APN-/-小鼠血清中则无法检测到脂联素（图1）。

图1 三组小鼠血清脂联素水平检测（***P＜0.001）

2.2 脂联素缺失纯合雌鼠的生育能力受损

8周龄的三组雌鼠各10只，分别与12周龄C57/BL6雄鼠按照1：1的比例交配，周期为28周，统计28周内各组雌鼠所生小仔数目。结果发现，APN-/-雌鼠所生仔数平均为18.2土3.3只，与WT雌鼠（30.5土3.7只）相比产仔数明显减少，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。虽然APN+/-雌鼠平均所生仔数与WT相比，差异没有统计学意义，但是数目却有减少的趋势，见表1。

表1 各组雌鼠生育力比较（ ± s，只）

表1 各组雌鼠生育力比较（ ± s，只）

与WT相比，*P＜0.05

组别 只数 产仔数WT 10 30.5±3.7 APN+/- 10 23.5±2.1 APN-/- 10 18.2±3.3*

2.3 脂联素缺失小鼠卵泡发育异常

对不同基因型小鼠卵巢各级卵泡发育情况的分析结果显示，WT小鼠卵巢各阶段卵泡卵母细胞均清晰可见，其外具有完整的透明带和排列规则的颗粒细胞。然而APN-/-小鼠的闭锁卵泡显著增加，腔前和腔卵泡数量显著减少。具体为：APN-/-小鼠闭锁卵泡的百分比为（19.6±0.9）%，显著高于WT小鼠闭锁卵泡的百分比（（8.7±0.6）%）（P＜0.001），此外，APN-/-组小鼠窦前卵泡和窦状卵泡的比例分别为（14.7±1.1）%和（8.9±0.8）%，显著低于WT小鼠的窦前卵泡（24.5±2.5）%和窦状卵泡（13.6±0.3）%的比例（P＜0.01）。而在这三组基因型中，原始卵泡和初级卵泡的百分比则基本相同。

3.讨论

脂肪组织对女性生育力调节起重要的作用，是因为它不仅可以进行能量储备，同时还具有内分泌作用。脂联素是一种重要脂肪因子，但肥胖症患者的血清脂联素水平反而是降低的。研究认为脂联素对于雌性卵泡发育，甚至是雄性的精子获能方面均有保护作用。

本研究发现脂联素缺失可导致雌性小鼠生育力下降，特别是APN-/-组，每只雌鼠的产仔数量均显著减少。与WT组相比，APN-/-组闭锁卵泡比例明显增加，同时窦前卵泡和窦状卵泡比例显著减少。说明脂联素水平的降低可以导致雌性生育力下降，脂联素对卵泡的发育成熟具有保护作用。卵泡发育是一个复杂过程，由多种激素控制，如雌激素、卵泡刺激素、黄体生成素和孕激素。研究表明可能影响卵巢的类固醇生成、卵泡发育和排卵，其基因表达的变化受到与卵泡发育相关激素的影响。而且在接受FSH治疗的妇女，其血清脂联素水平与体内获得的卵母细胞数量呈正相关。虽然在月经周期中脂联素浓度没有变化，但在雌二醇和黄体酮的产生、颗粒细胞增殖、卵母细胞成熟和死亡中发挥重要作用。这些研究表明，脂联素可能与卵泡的发育成熟和闭锁有关。因此我们推测，脂联素缺失导致的卵泡发育不良可能与卵泡发育相关激素水平的下降有关。与人类不同，小鼠有很高的繁殖能力，而在我们的研究中APN-/-小鼠表现出明显的生育力降低。因此，我们推断维持较高的血清脂联素水平对人类女性生育力尤其重要，其具体的作用机制也将是我们下一步研究的重点。