NaHS对PD小鼠纹状体的保护作用及对MMP-9和caspase-1表达的影响

肖 莉，李丹凤，石清明，何 甜，李澜芯，聂 政

帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一种多因素的神经退行性疾病，PD的病理特征是黑质及纹状体多巴胺（dopamin,DA）能神经元死亡和变性，其病因尚不清楚，除线粒体功能异常、氧化应激和α-synuclein蛋白的异常沉积外，神经炎症反应已被证实可触发和加重DA能神经元的变性[1-2]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)属于基质金属蛋白酶家族，MMP-9促进大脑炎性细胞（如小胶质细胞）的激活，而激活的炎性细胞又加重了DA能神经元的丢失[3-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)与炎症反应密切相关，caspase-1可以切割白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的前体，促进IL-1β 的成熟，IL-1β参与了帕金森病的发病过程[5-6]。硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)供体，在体内电离生成的HS-可与体内H+结合生成H2S，对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的PD小鼠DA能神经元损伤产生保护作用[7-9]。但其保护作用是否通过抑制MMP-9和caspase-1介导的神经炎症反应尚未明确。本研究通过构建小鼠PD模型，探讨NaHS对PD小鼠纹状体神经元的保护作用及其机制，对PD的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级KM小鼠30只，18～20 g/只，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂 NaHS（Sigma）；MPTP（aladdin）；羊抗兔IgG、GAPDH抗体（beyotime）；免疫组化试剂盒、caspase-1抗体、MMP-9抗体（boster）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及PD模型制备 将30只KM小鼠随机分为病理组（MPTP组）、治疗组（MPTP+NaHS组）和对照组（control组），每组10只。对3组小鼠进行腹腔注射给药，病理组小鼠注射MPTP[30 mg/(kg·d)]，治疗组先注射NaHS[3 mg/kg·d）]，0.5 h后再注射MPTP[30 mg/(kg·d）]，对照组注射0.9%的生理盐水。 注射后观察并记录小鼠行为变化，连续注射1 w后取材。

1.2.2 取材 10%水合氯醛麻醉，开颅取脑分离纹状体，免疫印迹法检测MMP-9、caspase-1的表达。4%的多聚甲醛固定脑组织用于HE染色和免疫组织化学染色。

1.2.3 HE染色 常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察和比较各组小鼠纹状体形态学改变。

1.2.4 免疫组化染色 采用SABC法进行MMP-9（1∶100）、caspase-1（1∶100）免疫组化染色，PBS代替一抗作阴性对照，10×40倍光镜视野下随机选择5个视野，统计MMP-9、caspase-1阳性细胞数。

1.2.5 Western blot 取出纹状体加入裂解液，充分研磨后，取上清，蛋白定量，电泳、转膜、封闭，孵育抗体，最后曝光。测定各组小鼠纹状体MMP-9（1∶1000）、caspase-1（1∶1000）蛋白表达的变化。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21分析所得实验数据，结果以x±s表示,各组均数比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用SNK-q检验和Tamhane's t2检验。P＜0.05有显著差异。

2 结果

2.1 小鼠的行为学改变 病理组第一次腹腔注射MPTP约0.5 h后，小鼠出现不同程度的呼吸急促、全身轻度抽搐、攻击、竖尾、抓鼻等症状，症状持续约10 min后逐渐减轻直至消失，最后一次注射后，对照组小鼠行为正常；治疗组出现上述症状明显较轻；病理组小鼠均在数分钟内产生上述症状。

2.2 HE染色结果 对照组纹状体区域神经元形态正常，数量较多，排列整齐，间质清晰。病理组神经元数量减少，部分神经元变性坏死、胞体红染、排列紊乱，胶质细胞增生。治疗组神经元缺失、发生变性坏死及神经胶质细胞增生程度较病理组明显减轻，见图1（箭头所示为坏死神经元）。

2.3 免疫组化检测MMP-9表达 免疫组化结果显示，MMP-9在小鼠脑组织纹状体区域主要表达于神经元胞质中，呈棕黄色。对照组（1.60±0.89）个几乎未见MMP-9阳性细胞，病理组MMP-9（32.2±3.63）个较对照组明显增多（P＜0.05），但细胞总数（包括正常细胞）减少。与病理组比较，治疗组（13.20±1.30）个MMP-9的表达减弱,阳性细胞数减少（P＜0.05），但细胞数量相对增加，见图2（箭头所示为MMP-9阳性细胞）。

2.4 免疫组化检测caspase-1表达 结果显示，caspase-1在小鼠脑组织纹状体区域主要表达于神经元胞质中，呈棕黄色。对照组阳性细胞数为（2.20±1.48）个，几乎未见caspase-1阳性细胞，病理组caspase-1阳性细胞数为（27.40±1.52）个，较对照组明显增多（P＜0.05），但细胞总数（包括正常细胞）减少。与病理组比较，治疗组为（14.20±0.84）个，MMP-9的表达减弱，阳性细胞数减少（P＜0.05），但细胞数量相对增加，见图3（箭头所示为caspase-1阳性细胞）。

2.5 Western blot检测MMP-9和caspase-1的表达Western blot结果对应位置出现目标蛋白（图4）。MMP-9结果MPTP处理后，与对照组0.25±0.13相比，MPTP组1.17±0.17的表达量明显增高（P＜0.05）。NaHS处理后，MPTP+NaHS组0.56±0.22蛋白表达量较MPTP组减少（P＜0.05）。Caspase-1检测结果显示，MPTP处理后，MPTP组1.15±0.03的蛋白量较对照组0.32±0.11明显增高（P＜0.05）。NaHS处理后，MPTP+NaHS组0.63±0.14蛋白表达量较MPTP组减少（P＜0.05）。

3 讨论

PD的病理特征是黑质及纹状体的DA能神经元死亡变性，其损伤的原因尚未完全清楚，近年来，除了线粒体功能异常、氧化应激和α-synuclein蛋白的异常沉积外，神经炎症也参与了PD的发病机制[10-11]。炎症反应可修复和清除机体有害物质，神经炎症反应也本应如此，但由于神经元一旦损伤便不可修复再生。所以，过度的神经炎症反应抑制神经元再生，也是引发PD及其他神经变性疾病的关键[11]。 纹状体的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)对刺激具有高反应性，MPTP可能诱导TNF-α和IL-1β增多，使纹状体的BBB通透性增加，纹状体DA能神经元丢失更加严重[12-13]。

MMP-9是一类由免疫细胞分泌的蛋白酶，遍及机体各种组织器官，降解和重塑细胞外基质。在中枢神经系统中，MMP-9虽然也可在正常人脑中被检测到，但其表达处于基础水平。但在病理条件下，如当PD发生后，其表达大量增加。MPTP的代谢产物MPP+可使DA能神经元变性，激活小胶质细胞，上调纹状体MMP-9的活性[14-15]。Annese等[4]也证实，在注射MPTP后，黑质和纹状体MMP-9含量增加，MMP-9激活IL-1β和TNF-α等炎性介质，促进胶质细胞的迁移和降解细胞外基质蛋白，增加BBB的通透性。在BBB血管侧的内皮细胞之间有提供结构完整性的复合物，包括紧密连接[16]。MMP-9破坏紧密连接，使BBB的作用被削弱，加重神经元丢失，同时炎性细胞向脑内的迁移加重神经元变性[7]。Caspase家族已被公认参与PD病理过程，加重DA能神经元的死亡，小胶质细胞因此活化，从而诱发caspase-1释放成熟的IL-1β和IL-18，这些炎症介质进一步加重DA能神经元的变性和MMP-9的释放[15,17]。因此，caspase-1诱导小胶质细胞介导的神经炎症，加重PD[18-19]。

图1 纹状体区域的病理学变化（×400）

图2 纹状体MMP-9免疫组织化学结果（×400）

图3 纹状体caspase-1免疫组织化学结果（×400）

图4 纹状体MMP-9、caspase-1的蛋白水平

H2S是一种气体递质，在调节哺乳动物生物事件中发挥重要病理生理作用，可以抗炎，抑制氧化应激，作为神经调节剂调节神经递质[20]。NaHS可以作为H2S的供体，使神经元免受MPP＋诱导的细胞毒性反应和细胞凋亡[21]。本研究通过建立小鼠PD病理模型，行为学改变提示NaHS预处理组能明显改善MPTP所致的PD小鼠出现不同程度的呼吸急促、惊厥、攻击、竖尾等症状。HE染色结果显示病理组神经元数量减少、排列紊乱、部分神经元坏死及周围见胶质细胞增生。NaHS预处理组神经元变性、丢失和神经元排列紊乱程度较病理组明显减轻。说明NaHS预处理组对PD小鼠纹状体神经元具有保护作用。各组小鼠大脑纹状体区域MMP-9及caspase-1主要表达于神经元胞质中，免疫组化和WB结果显示NaHS预处理组能显著抑制PD小鼠纹状体神经元MMP-9的表达。此结果说明NaHS可能通过抑制MMP-9的表达，减少炎性介质的释放、抑制炎性细胞向脑内的迁移浸润和细胞外基质蛋白降解有关。免疫组化和WB结果显示NaHS预处理组也可显著降低PD小鼠纹状体神经元caspase-1的表达。说明NaHS可能通过下调caspase-1的表达，减少IL-1β和IL-18等炎症介质的释放，从而减轻纹状体神经元的损伤。

综上所述，NaHS对MPTP所致PD小鼠纹状体具有保护作用。此作用可能通过抑制caspase-1的激活从而减少IL-1β和IL-18等炎症介质的释放，下调下游的MMP-9，对神经系统的炎症反应起到缓解作用，从而减少纹状体区DA能神经元变性和丢失有关。