NaHS对PD小鼠纹状体的保护作用及对MMP-9和caspase-1表达的影响

2021-06-08 06:42李丹凤石清明李澜芯
西南国防医药 2021年4期
关键词:纹状体阳性细胞变性

肖 莉,李丹凤,石清明,何 甜,李澜芯,聂 政

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种多因素的神经退行性疾病,PD的病理特征是黑质及纹状体多巴胺(dopamin,DA)能神经元死亡和变性,其病因尚不清楚,除线粒体功能异常、氧化应激和α-synuclein蛋白的异常沉积外,神经炎症反应已被证实可触发和加重DA能神经元的变性[1-2]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)属于基质金属蛋白酶家族,MMP-9促进大脑炎性细胞(如小胶质细胞)的激活,而激活的炎性细胞又加重了DA能神经元的丢失[3-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)与炎症反应密切相关,caspase-1可以切割白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的前体,促进IL-1β 的成熟,IL-1β参与了帕金森病的发病过程[5-6]。硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)供体,在体内电离生成的HS-可与体内H+结合生成H2S,对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的PD小鼠DA能神经元损伤产生保护作用[7-9]。但其保护作用是否通过抑制MMP-9和caspase-1介导的神经炎症反应尚未明确。本研究通过构建小鼠PD模型,探讨NaHS对PD小鼠纹状体神经元的保护作用及其机制,对PD的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级KM小鼠30只,18~20 g/只,购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂 NaHS(Sigma);MPTP(aladdin);羊抗兔IgG、GAPDH抗体(beyotime);免疫组化试剂盒、caspase-1抗体、MMP-9抗体(boster)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及PD模型制备 将30只KM小鼠随机分为病理组(MPTP组)、治疗组(MPTP+NaHS组)和对照组(control组),每组10只。对3组小鼠进行腹腔注射给药,病理组小鼠注射MPTP[30 mg/(kg·d)],治疗组先注射NaHS[3 mg/kg·d)],0.5 h后再注射MPTP[30 mg/(kg·d)],对照组注射0.9%的生理盐水。 注射后观察并记录小鼠行为变化,连续注射1 w后取材。

1.2.2 取材 10%水合氯醛麻醉,开颅取脑分离纹状体,免疫印迹法检测MMP-9、caspase-1的表达。4%的多聚甲醛固定脑组织用于HE染色和免疫组织化学染色。

1.2.3 HE染色 常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察和比较各组小鼠纹状体形态学改变。

1.2.4 免疫组化染色 采用SABC法进行MMP-9(1∶100)、caspase-1(1∶100)免疫组化染色,PBS代替一抗作阴性对照,10×40倍光镜视野下随机选择5个视野,统计MMP-9、caspase-1阳性细胞数。

1.2.5 Western blot 取出纹状体加入裂解液,充分研磨后,取上清,蛋白定量,电泳、转膜、封闭,孵育抗体,最后曝光。测定各组小鼠纹状体MMP-9(1∶1000)、caspase-1(1∶1000)蛋白表达的变化。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21分析所得实验数据,结果以x±s表示,各组均数比较采用单因素方差分析,组间差异比较采用SNK-q检验和Tamhane's t2检验。P<0.05有显著差异。

2 结果

2.1 小鼠的行为学改变 病理组第一次腹腔注射MPTP约0.5 h后,小鼠出现不同程度的呼吸急促、全身轻度抽搐、攻击、竖尾、抓鼻等症状,症状持续约10 min后逐渐减轻直至消失,最后一次注射后,对照组小鼠行为正常;治疗组出现上述症状明显较轻;病理组小鼠均在数分钟内产生上述症状。

2.2 HE染色结果 对照组纹状体区域神经元形态正常,数量较多,排列整齐,间质清晰。病理组神经元数量减少,部分神经元变性坏死、胞体红染、排列紊乱,胶质细胞增生。治疗组神经元缺失、发生变性坏死及神经胶质细胞增生程度较病理组明显减轻,见图1(箭头所示为坏死神经元)。

2.3 免疫组化检测MMP-9表达 免疫组化结果显示,MMP-9在小鼠脑组织纹状体区域主要表达于神经元胞质中,呈棕黄色。对照组(1.60±0.89)个几乎未见MMP-9阳性细胞,病理组MMP-9(32.2±3.63)个较对照组明显增多(P<0.05),但细胞总数(包括正常细胞)减少。与病理组比较,治疗组(13.20±1.30)个MMP-9的表达减弱,阳性细胞数减少(P<0.05),但细胞数量相对增加,见图2(箭头所示为MMP-9阳性细胞)。

2.4 免疫组化检测caspase-1表达 结果显示,caspase-1在小鼠脑组织纹状体区域主要表达于神经元胞质中,呈棕黄色。对照组阳性细胞数为(2.20±1.48)个,几乎未见caspase-1阳性细胞,病理组caspase-1阳性细胞数为(27.40±1.52)个,较对照组明显增多(P<0.05),但细胞总数(包括正常细胞)减少。与病理组比较,治疗组为(14.20±0.84)个,MMP-9的表达减弱,阳性细胞数减少(P<0.05),但细胞数量相对增加,见图3(箭头所示为caspase-1阳性细胞)。

2.5 Western blot检测MMP-9和caspase-1的表达Western blot结果对应位置出现目标蛋白(图4)。MMP-9结果MPTP处理后,与对照组0.25±0.13相比,MPTP组1.17±0.17的表达量明显增高(P<0.05)。NaHS处理后,MPTP+NaHS组0.56±0.22蛋白表达量较MPTP组减少(P<0.05)。Caspase-1检测结果显示,MPTP处理后,MPTP组1.15±0.03的蛋白量较对照组0.32±0.11明显增高(P<0.05)。NaHS处理后,MPTP+NaHS组0.63±0.14蛋白表达量较MPTP组减少(P<0.05)。

3 讨论

PD的病理特征是黑质及纹状体的DA能神经元死亡变性,其损伤的原因尚未完全清楚,近年来,除了线粒体功能异常、氧化应激和α-synuclein蛋白的异常沉积外,神经炎症也参与了PD的发病机制[10-11]。炎症反应可修复和清除机体有害物质,神经炎症反应也本应如此,但由于神经元一旦损伤便不可修复再生。所以,过度的神经炎症反应抑制神经元再生,也是引发PD及其他神经变性疾病的关键[11]。 纹状体的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)对刺激具有高反应性,MPTP可能诱导TNF-α和IL-1β增多,使纹状体的BBB通透性增加,纹状体DA能神经元丢失更加严重[12-13]。

MMP-9是一类由免疫细胞分泌的蛋白酶,遍及机体各种组织器官,降解和重塑细胞外基质。在中枢神经系统中,MMP-9虽然也可在正常人脑中被检测到,但其表达处于基础水平。但在病理条件下,如当PD发生后,其表达大量增加。MPTP的代谢产物MPP+可使DA能神经元变性,激活小胶质细胞,上调纹状体MMP-9的活性[14-15]。Annese等[4]也证实,在注射MPTP后,黑质和纹状体MMP-9含量增加,MMP-9激活IL-1β和TNF-α等炎性介质,促进胶质细胞的迁移和降解细胞外基质蛋白,增加BBB的通透性。在BBB血管侧的内皮细胞之间有提供结构完整性的复合物,包括紧密连接[16]。MMP-9破坏紧密连接,使BBB的作用被削弱,加重神经元丢失,同时炎性细胞向脑内的迁移加重神经元变性[7]。Caspase家族已被公认参与PD病理过程,加重DA能神经元的死亡,小胶质细胞因此活化,从而诱发caspase-1释放成熟的IL-1β和IL-18,这些炎症介质进一步加重DA能神经元的变性和MMP-9的释放[15,17]。因此,caspase-1诱导小胶质细胞介导的神经炎症,加重PD[18-19]。

图1 纹状体区域的病理学变化(×400)

图2 纹状体MMP-9免疫组织化学结果(×400)

图3 纹状体caspase-1免疫组织化学结果(×400)

图4 纹状体MMP-9、caspase-1的蛋白水平

H2S是一种气体递质,在调节哺乳动物生物事件中发挥重要病理生理作用,可以抗炎,抑制氧化应激,作为神经调节剂调节神经递质[20]。NaHS可以作为H2S的供体,使神经元免受MPP+诱导的细胞毒性反应和细胞凋亡[21]。本研究通过建立小鼠PD病理模型,行为学改变提示NaHS预处理组能明显改善MPTP所致的PD小鼠出现不同程度的呼吸急促、惊厥、攻击、竖尾等症状。HE染色结果显示病理组神经元数量减少、排列紊乱、部分神经元坏死及周围见胶质细胞增生。NaHS预处理组神经元变性、丢失和神经元排列紊乱程度较病理组明显减轻。说明NaHS预处理组对PD小鼠纹状体神经元具有保护作用。各组小鼠大脑纹状体区域MMP-9及caspase-1主要表达于神经元胞质中,免疫组化和WB结果显示NaHS预处理组能显著抑制PD小鼠纹状体神经元MMP-9的表达。此结果说明NaHS可能通过抑制MMP-9的表达,减少炎性介质的释放、抑制炎性细胞向脑内的迁移浸润和细胞外基质蛋白降解有关。免疫组化和WB结果显示NaHS预处理组也可显著降低PD小鼠纹状体神经元caspase-1的表达。说明NaHS可能通过下调caspase-1的表达,减少IL-1β和IL-18等炎症介质的释放,从而减轻纹状体神经元的损伤。

综上所述,NaHS对MPTP所致PD小鼠纹状体具有保护作用。此作用可能通过抑制caspase-1的激活从而减少IL-1β和IL-18等炎症介质的释放,下调下游的MMP-9,对神经系统的炎症反应起到缓解作用,从而减少纹状体区DA能神经元变性和丢失有关。

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