结直肠癌miRNA相关的Ascl2靶基因中的预后标志物

武 赟，胡文静，尚杨杨，汪荣泉

结直肠癌是全世界最常见的肿瘤之一，在癌症相关死亡原因中占第四位[1]。鉴定新的结直肠癌患者预后标志物具有临床应用价值。

miRNA对基因表达的转录后调节剂至关重要，参与多种生物学功能，如通过转录后调节各种癌基因和抑癌基因的表达控制细胞增殖，分化和凋亡；而且维持胚胎干细胞和人类肿瘤干细胞干性[2-4]。Ascl2编码的转录因子控制着肠道隐性干细胞和结肠癌祖细胞的命运[5-6]。本课题前期研究发现结肠癌细胞中Ascl2可以调控miRNA-200s的表达，从而对上皮间充质转变的可塑性产生影响，也可通过let-7b等调节结直肠前体细胞的干性[7-8]。

本研究使用生物信息学的方法，鉴定miRNA相关的Ascl2靶基因，并对其进行GO、KEGG分析，通过绘制PPI网络筛选关键基因，进一步结合TCGA数据集，探索其对结直肠癌患者潜在的临床预后价值，为结直肠癌提供新预后标志物。

1 资料与方法

1.1 数据收集 GSE34926和GSE69036表达数据来自GEO数据库，分别为对LS174T细胞干扰Ascl2表达前后miRNA与mRNA差异表达数据。545例结直肠癌病人临床数据及目标基因表达量来自TCGA数据库。

1.2 差异表达基因鉴定 GSE34926是比较干扰Ascl2前后的LS174T细胞的miRNA表达芯片的数据集。设定当Fold Change＞2或Fold Change＜0.5时，认为miRNA表达有显著差异。将标准化后的表达值取log2后，使用Helm绘图软件进行热图绘制。将得到的miRNA通过TargetScanHuman与miRBD进行靶基因预测，再通过Venn图寻找交集，得到Ascl2所介导差异表达的miRNA下游基因集，记为DEGs1。 数据集GSE69036为对LS174T细胞进行Ascl2干扰后与对照组相比，得出的受Ascl2所调控的下游靶基因。设定当Fold Change＞1.5或Fold Change＜0.67时，认为Ascl2干扰对此基因的表达有显著的影响，记为DEGs2。DEGs1与DEGs2之间的交集定义为miRNA相关的Ascl2的靶基因，并绘制Venn图。

1.3 GO、KEGG Pathway分析 对miRNA相关的Ascl2的靶基因进行GO分析[9]与KEGG Pathway分析[10]，利用可视化和集成发现数据库（DAVID）完成，并使用R软件中的ggplot2程序包完成结果的可视化。

1.4 制作差异表达基因的蛋白质相互作用（PPI）网络 DEGs的蛋白质互作网络（PPI network）使用STRING在线数据库构建。设定综合得分＞0.4的相互作用关系认为具有统计学意义[11]。通过Cytoscape软件及其插件cytohubba筛选degree≥10的基因为关键基因并绘制关键基因的互作网络图[12]。

1.5 结直肠癌患者的生存分析 使用x-tile软件筛选合适的cut-off值，分别将每个关键基因划分成相对高表达组与相对低表达组，通过Kaplan-Meier方法进行从3方面进行生存分析：总体生存率（OS）、无进展生存率（FPS）、疾病特异性生存率（DDS）。

2 结果

2.1 miRNA的差异表达及可视化 本课题前期对LS174T细胞行Ascl2干扰，对比分析干扰前后的LS174T细胞的miRNA芯片，其芯片结果发表在GEO数据库（GSE34926）。目前对GSE34926分析，发现在LS174T细胞被干扰Ascl2表达后，共有符合条件的350个miRNA出现差异性表达（172个上调，178个下调）。将标准化后的miRNA表达数据取log2，使用Helm绘图软件进行热图绘制（图1A：红色条带代表此miRNA相对高表达，绿色条带代表此miRNA相对低表达。）。

2.2 差异表达基因鉴定 将符合条件的350个miRNA使用TargetScanHuman与miRBD分别进行靶基因预测，再利用Venn图法寻找交集，得到Ascl2所介导差异表达的miRNA下游基因集，记为DEGs1。GSE69036为对LS174T细胞进行Ascl2干扰后与对照组相比得出的受Ascl2所调控的下游靶基因，它们包括由Ascl2直接转录调控的靶基因、通过miRNA介导转录调控的靶基因，以及经过其他分子中介调控的靶基因，这些差异表达的靶基因记为DEGs2。进一步，本研究利用Venn图绘制工具对DEGs1和DEGs2进行交集，共得到534个差异性表达基因（图1B），它们是Ascl2下游并且与miRNA相关的靶基因，记为差异性表达基因DEGs。

2.3 GO、KEGG Pathway分析 为了进一步揭示Ascl2下游并且与miRNA相关的靶基因的功能进行GO分析：分子功能上，DEGs富集在与蛋白质的结合，与金属离子的结合，转录因子的活动，与特定序列DNA的结合等方面；细胞组成上，DEGs主要富集在膜的组成部分，质膜成分，胞液、高尔基体及高尔基体质膜中；生物过程上，DEGs主要富集在基因的转录调控（包括RNA多聚酶Ⅱ启动子的负调控以及以DNA为模板的正调控），多细胞生物的发展等方面（图2）。KEGG Pathway分析发现DEGs集中在代谢相关通路、HTLV-I感染、MAPK信号通路、与癌症中的蛋白聚糖、癌症相关的miRNA等信号通路中（图3）。

2.4 差异表达基因的蛋白质相互作用（PPI）网络对534个DEGs进行PPI网络分析，用Cytoscape软件从其中467个有相互作用关系的基因中筛选出43个关键基因（degree≥10）。并使用Cytoscape软件中的cytohubba插件，将43个关键基因绘制PPI网络图（图4：红色表示相互作用关系较多，黄色表示相互作用关系较少）。

2.5 结直肠癌患者的生存分析 为了揭示43个关键基因的生物学功能以及临床可能的应用前景，笔者使用x-tile软件获得它们的cut-off值，将TCGA数据库中的545例样本划分为相对高表达和相对低表达组，用Kaplan-Meier对43个关键基因表达量与患者生存率进行分析，发现包括TP53、NRAS、WDTC1、TGFBR1、RAB1A、DYNLL2、RPS6KB1、COL1A1、CDKN1A、TNRC6A、DNMT3A、MAPT、RBBP5、PPARA、SERPINA1、COPG1、CCNE2、RAB6A、RYK、COPS3、FA2H、PRMT6、ANK1共23个基因相对表达量与患者总体生存率相关（P＜0.05）。本课题对结直肠癌患者中没有预后研究报道的RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1 4个基因进行生存分析。

RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1表达影响结直肠癌患者总体生存率（P=0.0280，P=0.0176，P=0.0188，P=0.0276）；DYNLL与COPS3的表达影响疾病特异性生存率（P=0.0191，P=0.0394）；COPS3的表达还影响无进展生存率（P=0.0446，图5）。

图1 标准化后miRNA取log2热图绘制及图法寻找交集

图2 对差异性表达基因DEGs的GO分析

图3 对差异性表达基因DEGs的KEGG Pathway分析

图4 DEGs中43个关键基因（degree≥10）的蛋白质互作网络图thway分析

3 讨论

Ascl2是一种与结直肠癌高度相关的转录因子，目前对于其靶基因的研究是热点之一，本研究通过对本课题前期发表GSE34926进行分析，鉴定出Ascl2被干扰后差异表达的miRNA[7]。对其靶基因进行预测并结合数据集GSE69036，共鉴定出534个与miRNA相关的Ascl2靶基因（DEGs）。行GO分析、KEGG Pathway分析，通过PPI网络分析鉴定出较为关键的43个基因，，结合TCGA数据库进行生存分析，共鉴定出23个基因表达量的高低对总体生存率有显著影响（P＜0.05），其中RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1四个基因与结直肠癌患者的预后研究缺乏文献报道，研究其表达量与结直肠癌病人临床预后关系对鉴定新预后标志物有指导价值。

图5 RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1表达水平对结直肠癌患者预后分析

Rab6A是Rab蛋白家族的一员，它位于高尔基池，以及负高尔基管网状结构中，与内质网和高尔基体的多种蛋白共同参与顺行转运，影响内质网折叠环境[13-14]。COPG1（衣被蛋白复合物亚基γ-1）一种细胞质蛋白复合物，能够通过与高尔基非网格蛋白包被的小泡可逆结合，介导生物合成蛋白从内质网通过高尔基到反式高尔基网络的运输。在GO分析发现DEGs在高尔基体以及高尔基体膜有较明显的富集，Rab6A及COPG1可能是通过蛋白翻译后修饰的过程影响细胞命运。Rab6A表达量与总体生存率呈正相关，而COPG1表达量与总体生存率呈负相关。DYNLL2又名为肝癌2缺失基因(DLC2)可以抑制肝细胞癌(HCC)的细胞骨架重组、细胞生长、细胞迁移和转化[15-16]。其在结直肠癌组织中的高表达提示较高的总体生存率和较高的疾病特异性生存率。

COPS3是COP9信号小体复合体(CSN)的第三亚基，CSN参与了广泛的生物学过程，如细胞因子信号、早期发育、DNA修复、细胞周期进程和转录激活及肿瘤发生[17]。COPS3的扩增与肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关[18]。本研究发现，COPS3高表达与结直肠癌患者的总体生存率、无进展生存率以及疾病特异性生存率均呈明显的正相关。

综上所述，本鉴定出结直肠癌细胞Ascl2可通过miRNA调控具有不同的生物学功能的靶基因，其中COPS3、DYNLL2、RAB6A与COPG1可成为预测结直肠癌患者预后的新标志物。