基于Pickering乳液模板法制备载万古霉素PLGA多孔微球的研究

李世杰，肖思萌，何 毅，彭 赞，黎 芳，马晓聪，梁健钦

慢性骨髓炎（chronic osteomyelitis）是骨科常见的疑难病种之一，治疗周期长、医疗成本高、治疗效果差、复发率高的特点。据报道慢性骨髓炎最常见的致病菌是金黄色葡萄球菌属的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），且临床检出率呈逐年上升趋势，从2006年的28.7%上升到2018年的39.8%[1]，常通过清创后在骨缺损处植入混有抗生素的骨水泥填补空腔予以治疗[2-3]。万古霉素（vancomycin，VCM）骨水泥是最常用的抗生素骨水泥[4]，但其杀菌浓度只能保持2～4 w，且常用的骨水泥材料如聚甲基丙烯酸甲酯在体内不能被降解[5]，VCM释放完全后需再次手术取出。为了提高VCM的治疗效果，可使用生物降解材料制备成缓释制剂。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid)，PLGA）是一种生物可降解的聚合物，在人体内可被降解为二氧化碳和水，由于其优异的生物相容性常被用作制备微球的材料，是骨组织复合支架的理想材料之一[6]。多孔聚合物材料载药后具有缓释、靶向作用，更适合慢性骨髓炎的治疗[7-8]。 羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨骼组织的主要无机成分，用HA作为骨科用材料具有良好的化学稳定性和生物相容性，同时HA还可作为Pickering乳液的一种乳化剂[9-10]。本研究以HA稳定的Pickering乳液为模板，通过一步法制备PLGA多孔微球，通过吸附法装载VCM得到载VCM的多孔微球，为开发治疗骨髓炎的载抗生素新剂型或骨组织工程复合支架提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 盐酸万古霉素（南京邦诺生物科技有限公司，批号20171201），(NH4)2HPO4（天津博迪化工股份有限公司），Ca(NO3)2（AR，天津市大茂化学试剂厂，批号20170416），泊洛沙姆（F-68）（Sigma公司，批号018K0029），PLGA50/50（LA∶GA=50∶50，黏度0.25 dl/g，批号2017072802）、PLGA75/25（LA∶GA=75∶5， 黏度0.26 dl/g， 批号2017081102）、PLGA50/50（LA∶GA=50∶50，黏度0.38 dl/g，批号2018012401）、PLGA75/25（LA∶GA=75∶25，黏度0.45 dl/g，批号2018012402）均购自深圳市博立生物材料有限公司，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

MSP-2S磁控离子溅射仪（孚光精仪（中国）有限公司），Quanta 250扫描电子显微镜（FEI公司），BA210 Digital数码显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Nicolet iS50 FT-IR傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞世尔科技公司），TG209 F3热重分析仪（德国NETZSCH公司），Zetasizer Nano ZSP纳米粒度分析仪（英国马尔文公司），ASAP2420-4比表面测定仪（美国麦克仪器公司），UV-9000紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 HA的制备 分别称取(NH4)2HPO42.56 g、Ca(NO3)27.52 g，置烧杯中，加水400 ml使溶解，将(NH4)2HPO4溶液缓慢加至Ca(NO3)2溶液中，搅拌，用氨水调pH值至10，静置12 h，离心（2000 r/min）10 min，弃去上清液，加水使沉淀重新分散，再次离心，重复该步骤，至沉淀物无明显氨味，取沉淀物，80℃干燥。

1.2.2 空白PLGA多孔微球的制备 （1）PLGA型号及用量：称取不同规格PLGA（用量为0.25 g、0.50 g）和致孔剂F-68（按PLGA重量的10%计），置100 ml具塞锥形瓶中，加二氯甲烷5 ml，振摇至溶解，作为油相；称取HA 0.1g，加水20 ml，超声（45 KHz，200 W）10 min，使HA分散，作为水相。将水相加入到油相中，振摇10 min，得到Pickering乳液，置摇床（30℃水浴，120 r/min），振摇，挥去二氯甲烷，滤过，置P2O5干燥器干燥，得到空白PLGA多孔微球。（2）致孔剂（F-68）用量：按照上方（1）选定的PLGA型号和用量，加入F-68（按PLGA重量的1.5%、2.5%、5%、10%计算），按照上述方法制备空白PLGA多孔微球。

1.2.3 载VCM的PLGA多孔微球的制备 采用吸附法载药。称取空白PLGA多孔微球200 mg，4份，置于5 ml离心管中，分别加入浓度为50、100、150、200 mg/ml的VCM溶液，振摇24 h，过滤，滤渣置P2O5干燥器干燥。

1.2.4 多孔微球的表征 （1）傅里叶变换红外光谱（FTIR）：分别取适量PLGA、HA、VCM、空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球进行红外波谱测定，波数范围设置在400 cm-1～4000 cm-1，重复扫描16次。（2）差示扫描量热（DSC）分析：分别取适量PLGA、HA、VCM、空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球、空白多孔微球与VCM物理混合物进行差示扫描量热分析，以10 K/min的速度进行升温，在25～600℃进行差示量热扫描，记录图谱。（3）粒度：分别取空白PLGA多孔微球、VCM-PLGA多孔微球，适量，配制成混悬液进行粒度检测。（4）比表面积及孔结构测定：空白PLGA多孔微球的比表面积及孔结构用比表面测定仪进行表征。通过N2吸附-脱附等温线的类型判断孔结构类型，并根据Barrett-Emmett-Teller（BET）方程[11]计算比表面积。

1.2.5 载药量 称取VCM-PLGA多孔微球50 mg，精密称定，置5 ml离心管，加二氯甲烷2 ml，超声（45 KHz，200 W）10 min，使微球完全溶解，静置2 h，加水2 ml，萃取，静置6 h，分取水层，重复萃取3次，合并水相，置10 ml容量瓶中，水浴60℃恒温24 h显色，室温冷却后加水定容至刻度，即得供试品溶液。采用紫外分光光度计法测定280 nm处的吸光度，用外标标准曲线法计算浓度[12]。按“载药量=药物的质量/微球的质量×100%”计算载药量。

1.2.6 体外释放度 分别称取载VCM的多孔微球和VCM原料药，3份，置20 ml离心管中，加入37℃预热的PBS缓冲液20 ml，置摇床中，在120 r/min、37℃条件下振摇，分别在第0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取样3 ml，测定280 nm处吸光度，并补足等体积PBS（37℃）。根据外标标准曲线法计算VCM浓度，并按下式计算药物累计释放率（%）。式中：Qn为累计释放率，C1,C2,…，Cn-1为第1，2，…(n-1)次取样时的样品浓度，W为载药量。

2 结果

2.1 HA的制备 HA的形貌不规则颗粒，大小不一。见图1。

图1 HA的SEM图

2.2 空白PLGA多孔微球的制备

2.2.1 PLGA型号及用量 PLGA用量为0.25 g时，得到的微球圆整，尤其是选用PLGA50/50（0.28dL/g）得到的微球圆整度好、多孔。因此，本实验选用的PLGA型号为PLGA50/50（0.28dL/g），用量0.25 g。 见图2。

2.2.2 F-68用量考察 F-68用量为1.5%、2.5%的样品成球率低，5%及10%的样品成球率较高，其中5%的样品球形更规整，因此确定F-68的最佳用量为5%。见图3。

2.3 载VCM的PLGA多孔微球 吸附法载药工艺中VCM浓度为200 mg/ml的样品在静置过程中逐渐凝固成蜡状固体，故排除进一步研究。另3个样品的结果见图4，载药后仍维持原来的高成球率及孔结构，且随着吸附药液的浓度升高，微球表面随之变得粗糙。

2.4 多孔微球的表征

2.4.1 多孔微球的红外光谱分析 HA在1016.01 cm-1处的P-O键非对称伸缩振动峰在合成空白PLGA多孔微球后蓝移至1031.37 cm-1，载药后，561.77 cm-1处O-P-O弯曲振动峰的吸收强度大幅降低[13]。空白PLGA多孔微球保留了PLGA在1747.77 cm-1处的C=O伸缩振动峰，载VCM后吸收强度降低[14]。见图5。

图2 多孔微球SEM图（×6000）

图3 空白PLGA多孔微球的SEM图（×6000）

图4 VCM-PLGA多孔微球SEM图（×12000）

图5 红外光谱图

2.4.2 差示扫描量热 （DSC）分析 结果见图6，HA在98.22℃有一个吸收峰，可能是样品含有少量水分形成的蒸发吸热峰；PLGA在53.09℃发生玻璃化转变，在339.48℃有熔点吸收峰；空白PLGA多孔微球在50.84℃保留了PLGA的玻璃化吸热峰，339.48℃处的熔点峰变平缓；VCM在79.40℃的吸热峰可能为吸热降解过程；VCM-PLGA多孔微球在55.21℃保留了PLGA的玻璃化吸热峰且强度变大，应是与VCM的降解峰重叠形成，PLGA的熔点峰右移至379.30℃处[14-16]。

图6 差示热分析图

2.4.3 粒度 空白PLGA多孔微球及VCM-PLGA多孔微球的粒度平均值分别为9.77μm、9.53μm。

2.4.4 比表面积及孔结构测定 结果见图7。样品的吸附曲线与脱附曲线不一致，出现迟滞回线，属于国际纯粹应用化学联合会提出的物理吸附等温线类型中的Ⅳ型曲线，表明样品中存在介孔结构。根据BET方程进行计算，空白PLGA多孔微球的比表面积为22.1643 m2/g。

图7 N2吸附-脱附等温线

2.5 载药量 吸附法载药中VCM浓度分别为50、100、150 mg/ml时，微球的平均载药量分别为4.67%±0.06%、6.62%±0.20%、7.56%±0.22%，组间比较均有显著差异（P＜0.05）。

2.6 体外释放度 VCM原料药0.5 h累计释放量为91.74%，1 h达到97.68%，药物在1 h内基本已完全释放。VCM-PLGA多孔微球在0.5 h累计释放量为64.94%，在5 h达到92.28%，大部分药物已被释放到溶液中。两组进行比较，微球组在3 h之内与原料药组有显著性差异（P＜0.05），具有缓释作用。见图8。

图8 VCM-PLGA多孔微球体外释放试验结果

3 讨论

本实验制备空白PLGA多孔微球的最佳制备处方和工艺为：以5 ml二氯甲烷、0.25 g PLGA（LA∶GA=50∶50，黏度：0.38 dl/g）、0.0125 g F-68为油相，以20 ml水、0.1 g HA为水相，两相混合振摇10 min得到Pickering乳液，置摇床（30℃水浴，120 r/min）振摇挥去二氯甲烷，滤过，干燥。接着，SEM可见该工艺下制备得到的微球具有丰富的孔，平均粒径约10μm，比表面积测定同样提示微球内部存在丰富的介孔结构，比表面积为22.1643 m2/g。最后，在体外释放实验中，VCM-PLGA多孔微球已经具有一定缓释作用。

综上所述，采用Pickering乳液模板法制备的PLGA多孔微球具有丰富的介孔结构，该结构是装载药物的主要场所；制备方法简便，只需经过一次乳化便能制备多孔微球，大幅提高制备效率且降低了制备所需条件水平；装载VCM的多孔微球已具有缓释作用，所用材料均为生物相容性高的材料，后期可以将载VCM的PLGA多孔微球进一步通过熔融烧结方法，制备得到骨组织复合支架，具备应用于骨科疾病治疗的潜力。