NRP-1在皮肤黑色素瘤中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响

洪小兰，吴海丽，谢彩丽，沈翠蓉，钱 江

黑色素瘤(melanoma)是一种源于皮肤、黏膜、眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑素细胞的恶性肿瘤，其恶性程度高，预后极差。超过95%的黑色素瘤发生在皮肤，称为皮肤恶性黑瘤（malignant melanoma，MM）[1-2]。由于MM对化疗或放疗不敏感，Ⅳ期黑色素瘤患者的5年相对生存率显著下降到10%[3-5]。因此，开发MM早期诊断及治疗的新靶点对提高皮肤黑色素瘤患者预后具有十分重要的意义。近年来，随着对皮肤黑色素瘤的深入研究，许多有效抑制MM生长和扩散的关键分子被鉴定出来，针对这些关键分子开发的靶向治疗和免疫治疗也取得了显著的治疗效果，预示了这一类药物的应用前景[6-8]。

NRP-1是一种多功能的非酪氨酸激酶受体，可作为血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）和轴突导向因子3(Semaphorin3,Sema3)的共受体，在血管生成，轴突引导，细胞存活，迁移和侵袭中发挥着多种作用[9-13]。相关研究提示，NRP-1在多种肿瘤组织中高表达，包括脑癌[14]，前列腺癌[15]，乳腺癌[16]，结肠癌[17]和肺癌[18]，并且NRP-1的表达水平与肿瘤进展呈正相关。然而，NRP-1在黑色素瘤中的表达及其作用的研究较少。本研究目的是探讨NRP-1在4种人皮肤黑色素瘤细胞株中的表达及在人皮黑色素细胞瘤组织中的表达。此外，为进一步探讨NRP-1对皮肤黑色素瘤的作用，本研究采用NRP-1单克隆抗体抑制NRP-1功能后探究NRP-1对皮肤黑色素瘤细胞增殖和凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养 人皮肤黑色素瘤细胞株SK-MEL-1，WM115，A-375，G361和人正常皮肤黑色素细胞株PIG1均购买于北京中源合聚生物科技公司。上述细胞均使用10%FBS和1%链霉素和青霉素的DMEM培养基于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱培养。

1.2 主要试剂与材料 组织芯片（含6例人正常皮肤组织与12例皮肤黑色素瘤组织）购买于中科光华(西安)智能生物科技有限公司；鼠源性NRP-1单克隆抗体与β-actin单克隆抗体购买于厦门闽博生物技术有限公司；HRP标记兔抗鼠抗体购买于厦门慧嘉生物科技有限公司；CCK-8试剂盒、免疫组化染色试剂盒购买于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清（GIBCO）；全蛋白提取试剂盒购买于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 蛋白免疫印迹 （Western blot） 参考文献报道的方法[19]，将处于指数生长期的细胞用细胞总蛋白提取试剂盒提取裂解，离心后收集上清液。加入4×上样缓冲液煮沸5 min，于4℃条件下保存。采用12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF膜上。室温封闭（5%脱脂奶粉的TBS封闭液）1 h后，加入一抗4℃孵育过夜，用TBST洗3遍，每遍10 min，加入荧光标记二抗室温孵育1 h，用TBST洗3遍后，滴加化学发光剂溶液（ECL）显影液在显影仪上进行显影。

1.4 免疫组化染色与评分 免疫组化染色参考文献报道的方法[20]，将石蜡切片至于60℃烘箱放置1 h后进行脱蜡、水化。脱蜡后，将浸入0.01 M枸橼酸缓冲液（pH 6.0），置入微波炉中加热10 min，进行抗原修复。进一步在组织切片上滴加3%过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶。最后分别加入鼠源性NRP-1单克隆抗体（一抗）和HRP标记兔抗鼠抗体（二抗）进行孵育，最后用免疫组化试剂盒对切片进行染色处理。免疫组化评分采用积分综合计量法，即NRP-1的表达指数=染色强度×染色细胞比例分数。

1.5 NRP-1单克隆抗体对皮肤黑色素瘤细胞增殖、凋亡的影响 取指数生长期的SK-MEL-1细胞稀释至10×105/ml，转移至12孔板于恒温培养箱培养6 h。本研究将细胞进行以下分组并做相应处理，每组设置3个复孔：（1）空白对照组：不做任何处理；（2）低浓度抗体组：加入20μl的1μg/ml浓度的NRP-1单克隆抗体；（3）中浓度抗体组：加入20μl的500μg/ml浓度的NRP-1单克隆抗体；（4）高浓度抗体组：加入20μl的1 mg/ml浓度的NRP-1单克隆抗体；分别在6 h、12 h、24 h和48 h，利用CCK-8试剂盒对各浓度抗体处理组进行细胞计数，细胞相对增殖活性=抗体处理组细胞数/空白对照组细胞数 ×100%。参考上述的分组与处理，在培养48 h后采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

1.6 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行数据处理和分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料以例和百分率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRP-1在4种皮肤黑色素瘤细胞株中的表达Western blot结果显示，NRP-1在4种人黑色素瘤细胞株（SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）中的表达量均明显高于人正常皮肤黑色素细胞株PIG1中的表达量（图1），以内参蛋白β-actin为对照，对3次独立实验的Western blot结果做半定量分析，结果（表1）显示，NRP-1在4种人黑色素瘤细胞株SKMEL-1，WM115，A-375和G361的相对表达量均较正常人皮肤黑色素细胞株PIG1高（P＜0.05）。其中，NRP-1在SK-MEL-1中的相对表达量最高，是在PIG1细胞株中的表达量的14.7倍。

2.2 NRP-1在皮肤黑色素瘤组织中的表达 含6例人正常皮肤组织与12例皮肤黑色素瘤组织的组织芯片的免疫组化结果见图2，NRP-1在6例正常皮肤组织表达量较低或无表达；而在12例皮肤黑色素瘤组织中均能检测到明显的NRP-1表达，呈浅棕黄色或深褐色。

2.3 NRP-1单克隆抗体对皮肤黑色素瘤细胞增殖的影响 结果见图3，低、中、高浓度组的细胞相对增殖活性均＜100%，即低、中、高浓度的NRP-1单克隆抗体均对细胞增殖有抑制作用。且随着培养时间的增加，NRP-1对细胞增值的抑制效果越明显。值得注意的是，NRP-1单克隆抗体处理48 h后，不同浓度抗体处理组的细胞相对增殖活性有显著差异，表现为低浓度组的细胞相对增殖活性大于中浓度组的细胞相对增殖活性，中浓度组的细胞相对增殖活性大于高浓度组的细胞相对增殖活性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 免疫组化检测NRP-1在人正常皮肤组织与皮肤黑色素瘤组织中的表达（标尺=50μM）

2.4 NRP-1单克隆抗体对皮肤黑色素瘤细胞凋亡的影响 典型的流式细胞术结果见图4A，NRP-1抗体组的凋亡（Q2区）细胞数明显较PBS组多，且随着NRP-1抗体浓度的增加，细胞凋亡数也随之增加。对3次独立实验做定量分析，结果见图4B，PBS组的细胞凋亡率为（1.43±0.15）%，低浓度组细胞凋亡率为 （5.57±1.44）%；中浓度组细胞凋亡率为（13.86±3.84）%， 高浓度组细胞凋亡率为（36.03±7.51）%。抗体处理组的细胞凋亡率均较PBS组高（P＜0.05）,且随NRP-1单克隆抗体浓度的增加，细胞的凋亡率也随之增加（P＜0.05）。

3 讨论

皮肤黑色素瘤对常规的放疗、化疗均不敏感。近年来，随着对皮肤黑色素瘤分子机制研究的深入，靶向治疗和免疫治疗已成为治疗皮肤黑色素瘤的一种很有前途的治疗方法。2014年，美国FDA批准了首个PD-1单克隆抗体用于晚期皮肤黑色素瘤的Ⅰ期临床试验。PD-1单克隆抗体的治疗获益率超过30%，晚期皮肤黑色素率的生存率明显增加。1，2，3年生存率分别为62%、44%及40%[21]。 筛选可用于靶向治疗或免疫治疗的靶点是提高皮肤黑色素瘤患者预后的关键。NRP-1是一种很有前途的肿瘤治疗靶点，被证实与多种肿瘤的不良预后相关，是近年来的一个研究热点。

本研究首先利用Western blot检测了4株人皮肤 黑 色 素 细 胞 瘤 细 胞 （SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）和人正常皮肤黑色素细胞株PIG1细胞的表达情况。结果提示（图1），NRP-1在人正常皮肤黑色素细胞中表达量较低。与正常皮肤黑色素细胞相比，4株黑色素细胞瘤细胞的NRP-1表达量均有不同程度的上调。其中，在SK-MEL-1和WM115细胞中表达最高。组织芯片的免疫组化结果（图2）与Western blot检测结果相符。在人正常皮肤组织中，NRP-1蛋白的表达量极低，几乎检测不到NRP-1的表达。而在人黑色素细胞瘤组织中均能检测到NRP-1蛋白的高度表达。上述结果提示，NRP-1在皮肤黑色素瘤中的表达较正常皮肤组织有显著上调。因此，NRP-1或是一个皮肤黑色素瘤诊断或治疗的有潜力的分子靶标。接着，本课题初步研究NRP-1单克隆抑制NRP-1功能后对皮肤黑色素瘤细胞增殖和凋亡的作用。结果提示（图3），NRP-1单克隆抗体能显著抑制人皮肤黑色素细胞瘤SK-MEL-1细胞株的增殖。且这种细胞增殖抑制作用与抗体的浓度有关。进一步流式细胞术研究提示（图4），NRP-1单克隆抗体也能促进SK-MEL-1细胞株的细胞凋亡。吕莎等[26]的研究提示，NRP-1单克隆抗体可通过PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号转导途径的活化来抑制细胞增殖和迁移，并通过Bcl-2/Bax/Caspase3途径诱导细胞凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。该研究结果与本研究的相符。

图1 Western blot检测NRP-1在4种皮肤黑色素瘤细胞株中的表达

图3 NRP-1单克隆抗体对皮肤黑色素瘤SK-ME-1细胞增殖的影响

图4 NRP-1单克隆抗体对皮肤黑色素瘤细胞凋亡的影响

本研究初步确定了NRP-1在皮肤黑色素瘤中有高表达，且NRP-1单克隆抗体可显著抑制皮肤黑色素瘤细胞的增殖、促进皮肤黑色素瘤细胞的凋亡。因此推测，NRP-1或是皮肤黑色素瘤的一个重要治疗靶点。后期可深入探讨NRP-1单克隆抗体抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的机制，或进一步在小鼠模型中评估NRP-1单克隆抗体在体内的肿瘤抑制作用。