RRM1及SOD2基因多态性与晚期NSCLC铂类化疗的相关性研究

贾钦尧，宋 珊，王 涛，向小均

非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常见的一种类型，在肿瘤中致死率最高。目前，第三代细胞毒药物联合铂类仍然是治疗晚期NSCLC标准化疗手段，但是肿瘤细胞基因的多态性往往会导致肿瘤细胞的异质性，以致化疗药物疗效个体差异较大，因此针对基因多态性调整化疗方案并实现个体化用药已成为临床治疗共识。超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase，SOD2)是一类可以催化超氧化物阴离子发生岐化反应的金属酶，在组织活性氧代谢中发挥重要作用，可能参与NSCLC耐药相关信号通路的激活[1]。核糖核苷酸还原酶亚单位1（ribonucleotide reductase M1，RRM1）可修复被铂类药物损伤的DNA，从而增加肿瘤细胞的耐药性，降低化疗受益率，其基因多态性可能影响晚期NSCLC的化疗效果[2]。本研究通过检测RRM1和SOD2基因多态性研究其和晚期NSCLC患者铂类化疗临床效果的相关性，探讨二者在晚期NSCLC治疗中的临床意义，为NSCLC精准医疗探寻理论基础。

1 资料与方法

1.1 病例资料 本研究采取随机数字法，随机抽取2017年5月～2019年10月来医院呼吸内科治疗，且经过病理切片结果诊断、3期或4期不能手术、病灶较大达到可以测量目的初治原发性肺癌患者252例，男性150例，女性102例，年龄31～78岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，患者入组前均签署知情同意书，且该研究已获得医院伦理委员会批准。

纳入标准：（1）经病理学、影像学（CT、X线）、纤支镜活检、肺穿刺等检测确诊为NSCLC；（2）Karnofsky评分≥70分，且预计生存期≥3个月，至少1个可测量病灶；（3）根据国际抗癌联盟TNM分期标准分为Ⅲa～Ⅳ期；（4）机体状况可耐受化疗。

排除标准：（1）合并其他危及生命的疾病患者；（2）治疗过程中存在的严重不良反应（中性粒细胞降低、神经毒性以及外周神经炎患者）危及患者生命安全；（3）存在哺乳期或孕产期妇女患者；（4）严重心脏、肝、肾功能障碍的患者；（5）对本研究药物过敏或者不耐受患者。

1.2 研究方法 所有患者均在医院接受以铂类药物为基础的化疗，如选择紫杉醇、吉西他滨或者培美曲塞+顺铂/卡铂，对于存在基因突变的患者，可接受靶向治疗，具体用药方案参照《Ⅲ期非小细胞肺癌多学科诊疗专家共识》中的常规推荐剂量[3]。

1.3 基因型分析方法 抽取患者治疗前的外周静脉血，使用EDTA抗凝处理后的全血(3 ml)在2500 r/min状态下离心2 min，取细胞上清得到血浆，通过QIAAMPDNA Blood Mini Kit试剂盒进一步纯化血浆DNA，得到血浆后放置-20℃保存待测。根据Genebank发布的人SOD2和RRM1基因序列采用Primer 5.0软件分别对相关位点设计引物。PCR反应体系为25μl，其中含10xbuffer 2.5μl、dNTPS 1μl、Taq DNA聚合酶0.4μl、DNA模板1uμl、引物1μl、ddH20补足。扩増方法：95℃条件下预变性5 min，94℃变性半分钟，50～60℃退火时间30 s，72℃延伸10 min，共35个循环。通过试剂盒回收目标片段，处理后通过DNA测序仪完成测定。

1.4 疗效评价 所有患者在使用含铂给药方法化疗2个周期，使用胸部CT对疗效复查，后续每1个周期进行疗效评价，联合化疗4个周期后停止化疗方案，临床效果分为完全好转（CR）、部分好转(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD),客观缓解率为CR+PR，毒性反应按National Cancer Institute毒性反应分级标准(NCICITC3.0)评定[3]。

1.5 统计学方法 所有数据均应用SPSS 20.0软件分析。其中计数资料以例和百分率表示，采用χ2检验，均以P＜0.05表示差异显著。采用Log-rank检验比较不同基因型的生存率，采用Cox比例风险模型评估各影响因素对化疗效果的影响。

2 结果

2.1 RRM1及SOD2的基因型及等位基因频率分布情况 RRM1基因RR37AC位点存在3种基因型：C/C、C/A、A/A，例数分别为74例、112例、66例。RRM1基因RR524CT位点存在3种基因型：C/C、C/T、T/T， 例数分别为102例、103例、47例。SOD2 SNPrs5746136位点存在3种基因型：G/G、G/A、A/A，例数分别为91例、107例、54例。SOD2 SNPrs2758331位点存在3种基因型：C/C、C/A、A/A，例数分别为72例、95例、85例。SOD2 SNPrs4880位点存在3种基因型：T/T、T/C、C/C，例数分别为98例、74例、80例。以上各基因位点基因型的观测值、期望值符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 临床疗效 252例患者中完全缓解54例，部分缓解68例，疾病稳定102例，疾病进展28例，其中总体客观缓解率（CR+PR）为48.41%（122例），疾病控制率(CR+PR+SD)为88.89%（224例）。

2.3 化疗疗效的单因素分析 依据治疗效果将患者分为：CR和PR为化疗有效组（122例），SD和PD为化疗无效组（130例）。两组患者的TNM分期、RRM1 RR524CT基因型以及SOD2 SNPrs4880基因型差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.4 影响化疗结局的多变量Cox模型 经过多变量校正，TNM分期（HR值为2.450）、SOD2 SNPrs4880基因型（HR值为2.085）以及RRM1 RR524CT基因型（HR值为1.523）对化疗结局有独立的影响意义（P＜0.05），见表2。

2.5 RRM1及SOD2基因多态性对预后的影响化疗结束后随访1年，死亡66例。RRM1 SNPrs488基因型C/C、其他（T/C、T/T）死亡人数分别为16例、48例，C/C、其他基因型的生存曲线见图1，不同基因型病死率差异有统计学意义（χ2=6.470,P＜0.05）。SOD2 SNPrs488基因型C/C、其他（T/C、T/T）死亡人数分别为30例、36例，C/C、其他基因型的生存曲线见图2，不同基因型病死率差异有统计学意义（χ2=7.755,P＜0.05）。

表1 化疗疗效的单因素分析

表2 影响化疗结局的多变量Cox模型

2.6 RRM1及SOD2联合基因型与化疗效果的关系 RRM1及SOD2多态性间在化疗敏感性方面存在明显的相互作用，携带至少1个RRM1 RR524位点的C等位基因和SOD2 SNPrs4880位点的T等位基因的化疗有效率明显高于其他基因型携带者（P＜0.05），见表3。

图1 RRM1 SNPrs488 C/C基因型、其他基因型的生存曲线

图2 SOD2 SNPrs488 C/C基因型、其他基因型的生存曲线

3 讨论

肺癌是现在发病率较高的肿瘤之一，其病死率为世界第一[4]。NSCLC占肺癌发病率的85%，由于症状不明显，所以大部分的患者就医时发现已进展至晚期[5-6]。化学治疗是最常见的治疗手段，三代细胞毒药物联合铂类仍然是标准一线化疗手段[7-9]。而在本研究中，患者经过一线治疗方案失败后，采取二线治疗方案，二线治疗方案主要采取培美曲塞进行治疗。本研究通过分析患者一线治疗中的RRM1及SOD2基因多态性与晚期NSCLC铂类化疗的相关性，为患者的治疗提供精准依据。

SOD是一类可以催化超氧化物阴离子发生岐化反应的金属酶[10]，文献中报道发现多种肿瘤组织中SOD2含量均异常增高，如王小俊等[9,11]研究发现SOD2基因多态性与小儿隨母细胞瘤的顺铂用药耳毒性相关，即基因多态性导致SOD2蛋白在结构与功能产生异变，最终影响化疗药物的药效。研究结果发现，SOD2 SNPrs4880基因型（HR值为2.085）是影响化疗结局的独立危险因素，其中携带突变等位基因的杂合子(TC)及突变纯合子(CC)对含铂方案的敏感率均低于野生纯合子(TT)，且随访1年，SNPrs488基因型T/T的病死率显著低于其他（T/C、C/C），表明突变等位基因C会降低化疗的效果。SOD2 SNPrs4880基因位点的缬氨酸突变为丙氨酸（T→C），导致SOD2上的线粒体靶向序列变化，使得该序列含有1个α螺旋结构，有利于SOD2前体经线粒体膜的转运过程，导致突变后的SOD2活性增加，从而增加了肿瘤细胞抵抗ROS应激诱导的损伤和降低肿瘤细胞的调亡，故而降低了含铂化疗方案的疗效。

RRM1基因可合成编码核糖核苷酸还原酶中的M1亚基，进而加强损伤DNA的修复，体内和体外实验中都发现RRM1的过量表达会降低细胞的运动、迁徙和转移的作用，达到抑制癌细胞的转移[12-13]。本研究发现RRM1 RR524CT基因型（OR值为1.523）是影响化疗结局的独立危险因素，且RRM1 SNPrs488等位基因的C/C基因型患者的病死率明显低于其他基因型患者（T/C、T/T），表明突变等位基因T会降低化疗的效果。研究认为RRM1 RR524位点的亮氨酸突变成甘氨酸，导致相应蛋白质的结构功能域发生改变，增加了DNA损伤修复能力，故而此类患者对铂类化疗药物的敏感性明显增加[14]。同时进一步分析发现RRM1及SOD2多态性间在化疗敏感性方面存在明显的相互作用，即：携带至少1个RRM1 RR524位点的C等位基因和SOD2 SNPrs4880位点的T等位基因的化疗有效率明显高于其他基因型携带者（P＜0.05）， 表明RRM1、SOD2基因多态性可能对临床化疗方案的制定具有指导意义。研究不足之处在于本研究例数较小，没有对不同地域和民族患者深入分析。受样本量限制，所以下一步研究应该扩大样本量和多样性，以证实二者基因多态性是否能够影响铂类药物治疗晚期NSCC的疗效。

表3 RRM1及S0D2联合基因型与化疗效果的关系(n)

综上所述，RRM1、SOD2基因多态性可影响晚期NSCLC患者对以铂类药物为主方案的化疗疗效及生存率，二者可联合应用可预测化疗疗效，提示可根据患者基因型来指导个体化治疗。